番茄功效与作用营养，种子影响果实发育

西红柿是研究更年期成熟的肉质水果的模型。番茄成熟不仅受到植物激素乙烯及其下游效应基因的控制，还受到多种转录因子的控制。据报道，转录因子APETALA2a (AP2a)、不成熟(NOR) 和果实丰满度是控制番茄果实成熟的主要调节因子。他们提出的功能源于对自然发生的突变体或RNAi 敲低菌株的表型研究，而不是目前出现的实际无效突变体。为了更详细地研究转录因子在番茄果实成熟中的功能，我们使用CRISPR/Cas9介导的诱变来敲除编码基因，并首次报告了这些突变体的表型。虽然观察到ap2a 突变体具有早熟、橙色成熟的表型，但无效突变体表现出比天然突变体温和得多的表型。进一步分析表明，自然发生的变异的严重表型是由显性失活等位基因引起的。我们的方法还为FUL1 和FUL2 的独立和重叠功能提供了新的见解。 FUL1 和FUL2 的单个无效等位基因和组合无效等位基因表明这两个基因在果实成熟中具有部分冗余功能，但在果实早期发育中没有。FUL2 的进一步作用也被揭示。

AP2A 突变体果实开始较早成熟，但未完全成熟。据报道，基于RNAi 12 的表达抑制，AP2a 是番茄果实成熟开始的负调节因子，但迄今为止尚不存在真正的敲除突变体。编码的401 个氨基酸蛋白质包含两个被认为参与DNA 结合的AP2 结构域，并且使用两个gRNA 可以创建两个相反的蛋白质，其中一个外显子的第一部分被删除。得到9。我们选择了最有可能是空等位基因的两个删除的行。在ap1a-cr35 中，连接两个gRNA 靶位点的27 bp 缺失预计会生成没有AP133 结构域的2 个aa 肽，而ap2a-cr2 等位基因中的67 bp 缺失由于核苷酸向上游延伸至起始密码子，因此不会产生预计会产生AP1a 蛋白。

尽管ap2a-cr2中的5 bp缺失延伸至AP2a的12'UTR，但这并不一定影响其转录。该突变删除了第一个起始密码子和第204 位氨基酸的另一个起始密码子。氨基酸位置5 处的下一个框内起始密码子位于两个保守的AP3 结构域编码区的第一个外显子2 中，因此它的使用不太可能产生功能性蛋白质。与野生型果实相比，两个品系的果皮在破壳期20天后仍保持橙色/棕色，并且没有完全变红。更快的成熟伴随着更快的老化。 ap2a-cr1 和ap2a-cr2 的果实在60 DPA 之前开始破裂，而其他突变体的果实保持完整。 ap2a突变体的果实ap39a-cr41和ap2a-cr1仅需2-2天即可达到Br阶段，明显短于野生型果实。这与7 天前观察到的RNAi 果实的颜色变化一致。证实了AP2a 在番茄果实成熟启动中的负调节作用。两种ap2 敲除突变体的果实在Br 阶段产生的乙烯至少是野生型的两倍。

已知拟南芥AP2 蛋白通过反馈控制负调节其自身转录。尽管RNAi 敲低表达通常会降低靶基因的mRNA 水平，但剩余的mRNA 仍然可以产生功能性蛋白质。除了提供更强的表型之外，不产生功能性蛋白质的突变体还允许探索蛋白质自身表达的正反馈或负反馈自动调节。这通过野生型果实和ap2a-cr1 和-cr2 果实中番茄AP2a mRNA 的表达分析得到了证明。由于这种突变没有产生功能性蛋白，因此突变果实表现出更高水平的AP2a mRNA，表明番茄AP2a蛋白负向调节其自身转录，类似于拟南芥AP2已被证明。 ap2a-cr1和ap2a-cr2产生更多的乙烯并且成熟得更快，证实了AP2a在乙烯产生和番茄果实成熟启动中的负面作用。由于缺乏番茄红素产生和叶绿素降解缺陷而导致的橙色/棕色果实颜色揭示了成熟中的积极调节作用，与Karlova 等人的RNAi 表型一致。

非无效突变体的表型高于天然存在的非突变体，自发或突变体中的成熟缺陷是由NAC-NOR的第三外显子（Solyc2g10）006880 bp缺失引起的移码和与完整基因的355 个氨基酸相比，截短的蛋白质为186 个氨基酸(aa)，并且该截短的部分位于NAC 结构域之后，并且截短的蛋白质仍然有可能保留二聚化和结合DNA 的能力。请从您的简历中删除NOR。 Moneyberg：我们为NAC-NOR设计了两个gRNA，但在T6位置没有发现编辑。获得了NAC 结构域编码序列5' 的两个等位基因，即在位置t1 处具有1 bp 删除的nor-cr1 和具有2 bp 删除的nor-cr3。两者都会导致移码，并且蛋白质预测仅包括NAC-NOR 的17 个氨基酸，而不包括保守的NAC 结构域。

纯合Nor-cr1 果实比野生型果实成熟晚。平均3天，但令人惊讶的是，成熟过程仅部分受到影响，而自然发生的突变体则被完全阻断。纯合的Nor-cr1 在60 DPA 时表现出橘皮现象，表明番茄红素生物合成受到影响。 Nor-cr1 果实破坏后的颜色变化比野生型果实慢得多，并且果皮在DPA > 70 时仍保持橙色。 Nor-cr1 果实在Br 和Br+ 5 天阶段的乙烯产量显着低于野生型果实，这可能是成熟开始延迟的原因，但也可能是由于自发或乙烯产量显着较高比突变果实。在正常的成熟时间内没有检测到乙烯。

alcobaca (alc) 突变编码NAC 结构域中的有害V106D 取代，是NOR 的等位基因，对成熟影响较弱。 CRISPR/Cas9 基因替换Yu 等人。在NAC-NOR 编码序列的第317 位用腺嘌呤替换胸腺嘧啶产生了ALC 等位基因，证实了ALC 的长保质期特性。三个Penjar 种质包含alc 等位基因，而第四个包含早期移码和6 个氨基酸截短的蛋白质，类似于此处描述的Nor-cr1 等位基因。我做到了。我们的Nor-cr1 果实表现出与alc 果实相似的延迟成熟和橙色成熟表型。 nor-cr1 的截短蛋白不包含NAC 结构域，可能使nor-cr1 成为真正的无效等位基因。

位于NAC 蛋白C 端区域的转录激活区域对于转录激活很重要，与NAC-NOR 相互作用的候选者包括NAC-NOR 本身形成同二聚体，或老化参与此过程的另外两个番茄NAC 蛋白包括NAC1 和NAC4。 NAC4 也证明了这种相互作用。 Nor-cr1中乙烯产量的减少证实NAC-NOR位于乙烯生物合成的上游，并作为具有积极调节作用的主调节因子发挥作用。

自发突变产生显性失活蛋白，这些蛋白自发成熟或以突变体形式成熟。为了方便起见，我们在这里将其称为nor-s。该等位基因被完全阻断，但在nor-cr1和alc水果中仅部分阻断。因此，我们假设nor-s中的不成熟表型是由以显性失活方式起作用的截短蛋白引起的，其蛋白产物与其他NAC蛋白相互作用并转录激活它们的靶标。 DNA 无需这样做。

这让人想起Poplar的NAC TF SND1。选择性剪接变体保留最终的内含子，并且提前终止产生没有激活结构域但具有几乎完整的NAC结构域的蛋白质。该蛋白充当其自身和家族成员及其下游靶标表达的显性失活抑制因子。这表明MADS-rin 等位基因会阻碍成熟，尽管新形成的RIN-MC 融合蛋白具有rin 敲除菌株中未见的新的表达和转录激活组合。提醒我。为了进一步研究这一点，我们在自然发生的、突变型和野生型Ailsa Craig 背景中的NOR 自然突变位置的5' 处引入了突变。两个等位基因，nor-scr1 和Nor-scr2，分别具有1 bp 缺失和插入，是在天然存在的Nor-s 突变体背景中获得的，并且在野生条件下获得了一个与Nor-scr2 具有相同特征的等位基因。 A 1 bp 插入等位基因(nor-cr2) 由Ailsa Craig 型获得。

纯合Nor-cr2 导致Ailsa Craig 果实橙皮成熟，纯合Nor-scr2 和双等位基因Nor-scr1/nor-scr2 突变体也是如此。因此，我们可以得出结论，自然突变的上游移码阻止了NAC 结构域的翻译，并废除了保留完整NAC 结构域的自然突变的显性失活功能。经典的显性失活TF 仍然与野生型蛋白相同的调控DNA 元件相互作用或形成相同的二聚体，但杂合二聚体比纯合野生型小25%。由于它只是高度活跃，因此表型是： 38.cv 的纯合变体与杂合Nor-s 变体比杂合Nor-s 变体更相似。

罗格斯在成熟时间、胡萝卜素产生和成熟过程中乙烯产生方面具有中间表型。这表明nor-s的副作用是剂量依赖性的。这表明nor-s是所谓的反式作用显性失活等位基因，具有位点间相互作用而不是经典的位点内相互作用，而番茄NAC1 TF和NAC4 TF也具有这种位点内相互作用。

尽管FUL1 和FUL2 在果实成熟过程中具有重叠的功能，但FUL2 在果实发育中发挥着额外的作用。由于番茄FUL1 和FUL2 是相似的旁系同源物，因此RNAi 介导的表达以特异且有效的方式实现。击倒尤其困难，并且其利用也很困难。使用低特异性的RNAi 构建体可能会导致多个同源基因的敲低。在报道番茄中FUL 基因敲除的两项研究中，两种敲除是同时实现的，而在另一项研究中，每个基因的敲除相对较弱且不完全特异性。

这些结果表明FUL1 和FUL2 在番茄果实成熟中至少部分是多余的，但这两个基因的相对作用尚无定论。因此，我们使用CRISPR/Cas1生成ful2和ful9的单突变体和双突变体。我们单独和组合获得了FUL1 和FUL2 的多个敲除等位基因。使用含有两个基因的sgRNA 的构建体获得双突变体。 ful91单突变株含有ful1-cr1等位基因，有1 bp缺失，是由双链断裂的微同源定向修复引起的，完全删除了第二个外显子，导致62个氨基酸裂解。可能产生仅MADS结构域。蛋白质。突变等位基因ful1-cr1 中的1 bp 缺失截断了第2 位氨基酸。

两个等位基因都废除了FUL1 功能。在ful1 单突变体中，ful2-cr2 等位基因在MADS 结构域编码区中部插入了1 bp，导致蛋白被截短，只有1 个氨基酸。 ful1-cr3 等位基因中FUL2 中的2 bp 缺失可以产生除高度保守的MADS 结构域中间的一个氨基酸（精氨酸2）之外的整个蛋白质。这种突变可能对蛋白质功能有害，Provean蛋白质网站的分析进一步支持了这一点（Provean评分：-25.12），获得的其他等位基因显示在补充图中。我们还检查了FUL1 和FUL2 的非靶向旁系同源物的相应部分的序列。相互但没有发现突变，证明了sgRNA的高度特异性。

有趣的是，我们在ful2-cr 突变体中观察到了以前在RNAi 敲除菌株中未报道过的表型。在果实发育的早期阶段，纯合ful2-cr1果实在底部呈现出比周围果皮更浅的表面条纹，但纯合ful1-cr1果实的情况并非如此，并且随着果实成熟。其分辨率降低。在两个双突变体ful1-cr2/ful2-cr2和ful1-cr2/ful2-cr3的所有果实的底部也发现了相当明亮的色素条纹。仅当野生型果实完全成熟时，才会从白色变为黄色。这些条纹不仅在表面可见，而且在纯合ful1/ful2双突变体切片的中果皮中也可见，果皮和隔膜的基部区域的颜色比果实的其余部分浅得多。

此外，从果实发育的早期阶段开始，所有ful2 突变体品系（包括双突变体品系）的表面上都可以看到垂直裂纹，这可能是由于日照造成的。此外，ful2和ful1/ful2果实的果皮和胎盘即使在果实完全成熟时仍保持白色。此外，我们注意到所有携带ful2 无效等位基因的突变体的果实在直径和高度上都比野生型果实小10 毫米以上。重量几乎是野生型果实的一半，ful2对成熟开始（Br阶段）也有显着影响。 ful46-cr1的果实需要一天的时间才能开花，ful43-cr2的果实只需要一天的时间就可以开花。这比野生型果实明显短。在两个双突变系中，成熟时间也显着短于野生型果实，但果皮在DPA 达60 时仍保持橙色，并且没有达到野生型果实中的红色成熟颜色。我们推测ful2突变体较小的果实尺寸可能与早熟表型有因果关系，但这需要进一步研究。

单突变体和双突变体对乙烯产生的累加效应表明FUL1 和FUL2 在乙烯生物合成和果实成熟中的部分冗余功能。这与Bemer 等人证明的淘汰生产线中乙烯产量不变形成鲜明对比。我们的研究中Ful1/2双敲除突变体中乙烯水平显着降低表明FUL1和FUL2通过乙烯生物合成调节番茄果实成熟，这与其他研究一致。研究之间的这些差异可能是由于使用了不同的基因型以及先前分析的RNAi 菌株的有限下调所致。在这里，我们表明，在ful1/ful2双突变体中，与nor-cr突变体相似，只有不到三分之一的野生型乙烯产量仍然可以支持某种程度的成熟进程；有人提出，存在一个可用的乙烯数量有限。最初可能需要乙烯，一旦达到阈值，成熟就会开始，即使尚未完全进展。

总之，我们已经证明了CRISPR/Cas9 诱变在番茄中重新评估转录因子基因功能的效用。尽管一些表型与之前报道的非常相似，但可以研究额外的调控特性，例如转录的自动反馈控制（ap2a）和重翻译的互补。对于某些人来说，研究替代等位基因还可以通过分别揭示无效等位基因和显性失活等位基因（nor-s）之间的差异来更深入地了解基因功能。最后，基因定向诱变使我们能够分离一对高度相似的旁系同源物（ful1 和ful2）的功能（或显示冗余），而使用RNAi 和VIGS 等旧方法很难分离这些旁系同源物。