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NNMT 使用SAM 作为辅助因子催化烟酰胺甲基化，生成1-甲基烟酰胺。最近的研究表明，癌症相关成纤维细胞(CAF) 中NNMT 的上调是维持高级别浆液性癌中CAF 表型所必需的。这些观察结果表明NNMT 正在被评估为癌症治疗的有效靶点。尽管已经鉴定了几种NNMT 小分子抑制剂，但仍然需要具有良好体内活性和ADME 特性的高效、选择性抑制剂作为可靠的化学探针。氮杂吲哚甲酰胺38 已被确定为一种选择性有效的NNMT 抑制剂，具有优异的口服生物利用度和药物特性，以及良好的PK/PD 和安全性。随后的机理研究表明，38不竞争性结合SAM，但确实结合烟酰胺，这与烟酰胺结合位点的结合一致以及与SAM的正相互作用可能形成效应。

烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）为辅因子，催化烟酰胺甲基化生成1-甲基烟酰胺（1-MNA）。烟酰胺是维生素B3 的一种，也是NADH/NAD+ 辅因子的组成部分，对新陈代谢至关重要。 NNMT 最初被鉴定为烟酰胺清除酶。然而，最近的研究表明，NNMT 超越了生物过程中的新陈代谢，包括人类疾病生物学。 NNMT 有助于调节生物可利用烟酰胺的浓度。这会影响NAD+ 的合成以及NAD 结合蛋白（包括乙酰化酶）的功能和表达。 NNMT 还减少了SAM 辅因子（一种重要的生物甲基来源）的量，远离其他SAM 依赖性功能，例如组蛋白甲基化。 NNMT 过度表达也在癌症中观察到，包括高级别浆液性癌(HGSC) 和其他预后不良的疾病。研究表明，来自转移性HGSC 患者的癌症相关成纤维细胞(CAF) 中NNMT 表达上调，并且需要高水平的NNMT 来维持CAF 表型。 CAF 是肿瘤微环境的组成部分，支持肿瘤的存活、生长和转移。鉴于CAF 在肿瘤支持中的作用以及NNMT 高表达支持卵巢癌迁移的发现，NNMT 已成为卵巢癌有希望的治疗靶点，可以重塑肿瘤微环境。由于NNMT已成为潜在的治疗靶点，特别是在肿瘤学领域，因此使用具有良好体内特性的小分子抑制剂作为探针来探索这种治疗潜力非常重要。尽管NNMT 抑制剂的开发取得了进展，但大多数抑制剂尚未在体内证明NNMT 抑制作用和有利的ADME 特性。人们已经考虑了多种开发NNMT 抑制剂的方法。先前的策略是设计同时占据烟酰胺和SAM 结合位点的双底物类似物。双底物抑制剂如NS1 (Ki=0.510.08nM) 和LL320 (Ki=1.60.3nM) 在生化检测中非常有效，但其极性导致细胞通透性较差。已开发出具有中等功效的大环细胞穿透肽抑制剂（基于细胞的IC50=770nM）。最近的一项专利描述了一种EL-1 共价抑制剂，可抑制小鼠体内1-MNA 水平长达4 小时（体外IC50=74nM），但有关选择性和ADME 的信息尚不清楚。开发NNMT 抑制剂的另一种方法是设计专门占据烟酰胺结合袋的化合物。目前，AK-4 是此类化合物中报道的最有效的化合物（体外IC50=70nM），但其体内PK/PD 特性尚不清楚。一种较弱的NNMT 抑制剂5-amino-1-methylquinolin-1-ium（图1，脂肪细胞EC50=2.3 M）具有细胞渗透性，已被证明可用于大鼠和小鼠模型。然而，尚未报道体内直接抑制NNMT 的证据。

图1.基于烟酰胺的NNMT抑制剂化合物的体外IC50值。有效化合物的95% 置信区间表示为低于IC50 的值范围。 JBSNF-000265（14，图1）是赛诺菲开发的小分子NNMT抑制剂。它具有中等的NNMT 抑制效力(IC50=1553nM) 和可接受的细胞渗透性。然而，该化合物在小鼠体内显示出高清除率，并且仅抑制NNMT 约2 小时。尽管如此，良好的效力和细胞渗透性凸显了JBSNF-000265 作为进一步开发的可行起点。烟酰胺和JBSNF-000265（14，图1）的结构类似物旨在提高效力并获得良好的PK 和PD 特性。分子对接操作(MOE) 和之前求解的晶体结构用于通过虚拟对接NNMT 烟酰胺结合位点来辅助模拟设计。这些直接研究产生了化合物38（图3），这是一种氮杂吲哚甲酰胺，在细胞中具有有效的NNMT 抑制作用，并显着改善了药代动力学和药效学。在体外生化和细胞实验中，化合物38抑制NNMT，IC50分别为42 nM和38 nM。它对肝微粒体稳定，对NNMT 具有高度选择性。体内实验表明，38 在提供高NNMT 目标范围的剂量下具有良好的耐受性。在50mpk 的BID 剂量下，38 在24 小时的大部分时间内抑制NNMT。这些和其他结果表明38 是一种有用的NNMT 体内化学探针，具有临床研究应用的潜力。

SAR：烟酰胺系列

制备了结构与JBSNF-000265 相似的化合物库。这些化合物对抗人类NNMT (hNNMT) 的效力是使用Promega 开发的基于发光的生化甲基转移酶测定法测定的。其结构及效果如图1所示。观察到羧胺部分位于杂环平面内，其中羰基氧面向吡啶氮。发现采用这种构型(1-5)的甲酰胺产生非活性化合物。类似于1-MNA(6-8)N-甲基的结构也是不活泼的。 4-（9，烟酰胺编号）或2-（10）位置的单甲氧基取代会导致失活。当甲胺连接到4-位时，得到活性有限的化合物(11)。正如预期的那样，4-甲基烟酰胺(12) 是NNMT 的底物。此前，据报道6位甲氧基（13，命名为JBSNF-000088）和甲胺（14，命名为JBSNF-000265）具有良好的耐受性。尝试延长或除去烷基(15) (16) 导致活性降低。对结合位点的检查表明，4 位有替换的空间。因此，在位置4 处添加一个小组并结合位置6 处的替换可以增加效力。甲基(17) 优于氯(18)，并且两者都比甲氧基(19) 更耐受。三氟甲基取代(20) 使化合物失去活性。当中心吡啶被其他杂芳族系统取代时，活性急剧下降(21-24)。用磺酰胺(25) 替代甲酰胺也不利于功效。尽管模型预测甲基应位于4 和5 位（图2a），但相应的化合物(26) 不活跃。据推测，烯丙基应变迫使N-Me 基团旋转，并且该方向不适应烟酰胺结合位点（图2b）。氮杂吲哚样主链被认为可以在构象上将取代基固定在首选几何形状的位置5 和6 处（图2c）。事实上，获得的化合物(27)抑制NNMT，IC50=175 nM。

图2.7 氮杂吲哚骨架设计概述(a) 化合物26（橙色）和化合物27（绿色）分别与NNMT（PDB：5YJF）的烟酰胺结合位点进行分子对接。将SAH 硫醚桥转化为甲基磺酰胺以模拟SAM。 (b) 化合物26 的渲染图，显示了结合所需的分子内键。 (c) 图27 的渲染，突出显示氮杂吲哚骨架的几何形状。

SAR：氮杂吲哚系列27的发现导致人们试图确定新形成的五元环是否是最佳的，以及烟酰胺系列是否保留了唑啉系列的倾向。为了实现这一目标，我们合成了一系列化合物27 类似物并进行了效力测试（图3）。

图3.唑啉NNMT抑制剂化合物的体外IC50值。有效化合物的95% 置信区间表示为低于IC50 的值范围。对接化合物27 揭示了五元环周围的额外空间（图2a）。环延伸至哌啶(28) 或吗啉(29) 会降低效力，但28 的IC50 仍为亚微摩尔，为740 nM。在第二个环中引入额外的杂原子均匀地降低了活性，表明口袋的亲脂性。含有氧化五元环（30、31）的化合物没有功效。有趣的是，当位置6（烟酰胺编号）处的氮被氧（32）取代时，所得化合物成为甲基转移底物。无论第二环(33, 34) 是什么，这种趋势都会保留。这可能表明胺氢形成了锁定到抑制结合构象而不是甲基转移结合构象的键。此外，胺可以增加吡啶氮的碱性，导致氮键形成并阻碍甲基转移。第二个观察结果与2-氨基吡啶(pKa=6.86) 的酸性低于2-甲氧基吡啶(pKa=3.28) 一致。在7-氮杂二氢吲哚被确定为最有前途的支架后，人们尝试用亲脂性取代基填充结合袋中的剩余空间。之前对烟酰胺系列的SAR 和分子对接（图2a）表明，在4 位（氮杂吲哚啉编号）引入甲基或氯是可以容忍的。正如预期的那样，相应的4-甲基(35) 和4-氯(36) 化合物显示出略微改善的效力，IC50 值分别为102 nM 和92 nM。化合物35 的吡啶N-氧化物(37) 的效力比其未氧化的前体(35) 低50 倍以上。接下来，我们关注二氢吡咯环上的取代。在两个位置的pro-R 氢上方都发现了狭窄的空白空间（图2a）。甲基的引入填充了该空间并形成了化合物38，IC5042nM。相应的S-对映异构体(39) 的效力低300 倍。事实上，在父S 平面上的两个位置（41、43、47、49）引入群是有害的。随后尝试将R-2-甲基延伸至乙基(40) 或丙基(42)，结果导致功效显着降低。研究了化合物38 的替代方法。在4 位添加甲基(44) 或氯(45) 得到大致相当于38 的化合物。制备并分离反式2,3-二甲基类似物的外消旋混合物。一种对映体的IC50 值为20nM。 SAR趋势表明活性对映体可能是46。 2,3-顺式二甲基化合物(48, 49) 是底物。

细胞效力和体外微粒体稳定性在鉴定了九种活性化合物后，确定了抑制剂在细胞中的效力。 K562 细胞被给予NNMT 抑制剂，浓度范围为0.1 nM 至10 M。孵育24 小时后，裂解细胞并使用定量质谱法测定1-MNA 的量。绘制浓度图并将细胞电位外推为IC50 值。实验结果如表1所示。化合物17、35、38和44的IC50值分别为25、23、38和12 nM。这些化合物的细胞内活性也表明它们具有优异的细胞渗透性。不幸的是，没有证据表明人类癌细胞系对NNMT 抑制剂高度敏感。为了支持这一点，NNMT 的DepMap 分析表明0/1086 细胞系对NNMT 的CRISPR 敲低敏感。因此，我们无法在人类癌细胞系中测试这种抑制剂，已知人类癌细胞系对NNMT 的小分子抑制高度敏感。

图4. C57BL6/N 小鼠口服50mpk 后NNMT 抑制剂血浆浓度的变化。

表1. NNMT 抑制剂的效力和微粒体稳定性。

接下来我们测量了这些化合物在肝微粒体中的稳定性。将先导化合物暴露于人类(HLM) 和小鼠肝微粒体(MLM) 并监测代谢清除率（表1）。大多数类似物可抵抗微粒体代谢，并且在60 分钟内几乎没有降解。值得注意的例外包括35 和36。 MLM 和HLM 中均发生了36 的中度降解。 35 在HLM 中抵抗降解，但在MLM 中启动新陈代谢。 4-甲基吡啶和4-氯吡啶已知的代谢不稳定性可以解释它们的降解。化合物44直接用于体内实验。化合物38和44是两种最有前途的先导化合物，在HLM中具有良好的稳定性。

NNMT 抑制剂在雌性C57BL6/N 小鼠中的PK/PD 微粒体稳定且有效的细胞渗透性NNMT 抑制剂的发现促进了对其体内功效的评估。在雌性C57BL6/N 小鼠中进行药效学和药代动力学研究。每种抑制剂以三种单独的给药方案给药：1mpk IV、10mpk PO 和50mpk PO。然后使用MS 监测抑制剂和1-MNA 的血浆浓度24 小时。表2 显示了每种抑制剂50mpk 组的平均药代动力学参数。

表2. 50 mpk PO 剂量下NNMT 抑制剂的平均药代动力学参数。

如图4 所示，大部分化合物很快被去除。 Cl值35、36、44匹配或超过肝血流量。尽管在整个剂量范围内生物利用度(F%) 高，但低剂量的抑制剂在血浆中的半衰期较短。这些数据表明清除机制可能涉及NNMT 本身对抑制剂的甲基化。较高剂量虽然具有生物利用度，但可能会使靶标饱和并减慢清除速度。尿液排泄可能是35 和36 等短寿命化合物的另一种可能的消除途径。在测试的抑制剂中，38 种的清除率最低，暴露率最高。这会导致更长的靶向效应，这反映在1-MNA 的血浆浓度中（图5）。化合物38 还在50mpk 剂量下与靶标相互作用超过6 小时。值得注意的是，相同剂量的44 可抑制血浆1-MNA 浓度长达8 小时。正在进行实验以进一步研究44 名个体的PK/PD 概况。

图5. 50 mpk PO 给予NNMT 抑制剂后雌性C57BL6/N 小鼠血浆1-MNA 浓度的变化。受到这些有利的体内特性的鼓励，研究人员研究了两种剂量(BID)。进行了一项研究以确定是否38 PK和PD 进行了治疗。 ）（图6）。对小鼠施用50mpk 超过2 周，可维持总体暴露（图6a）和目标暴露。在50 mpk BID 下，1-MNA 抑制维持6 小时，总接触时间减少最少（图6b）。将38 从50 mpk 增加到100 mpk 显着增加了总暴露量（图6c），并增加了1-MNA 抑制从6 小时到8 小时（图6d）。这表明38 的靶向作用是剂量依赖性的。在这些研究中，小鼠没有表现出不良的健康影响。这些数据表明，每天食用两次NNMT 可以使NNMT 在一天的大部分时间里保持稳定状态。有趣的是，给药后24 小时1-MNA 水平比给药前更高。

图6. 不同剂量方案下38 在C57BL6/N 小鼠中的药代动力学和药效学：(a) 50mpk 给药后38 的血浆浓度，(b) 50mpk 给药后1-MNA 的血浆浓度，(c) 2 次给药。 QD 给药几周后的38，(d) QD 给药2 周后38 的1-MNA 血浆浓度。

先前关于化合物38的抑制机制的报道表明烟酰胺类似物如JBSNF-000088占据烟酰胺结合袋。然而，抑制机制以及为什么它作为抑制剂而不是底物尚未阐明。化合物38也是烟酰胺的结构类似物并且可能占据相同的位点。在这种情况下，可能存在三种抑制机制：(1) 38 被SAM 甲基化，产生活性抑制剂；(2) 38 竞争性结合两种底物，抑制SAM 结合。(3) 38 竞争性结合烟酰胺，但不结合SAM 。 NNMT 在室温下可以缓慢甲基化38。为了探索第一个可能的机制，我们制备了化合物38 (50) 的N-甲基类似物，并在生化测定中对其进行了测试（图3）。 N-甲基化的效力降低了100 倍，表明没有产生活性抑制剂。接下来，确定了38的IC50与SAM和烟酰胺的浓度之间的关系（图8）。 38的IC50与烟酰胺浓度呈正线性相关（图8a），表明38与烟酰胺口袋结合。将这些数据拟合到竞争性抑制模型中，烟酰胺的Km 为13.88 M。 38 的IC50 显示与SAM 浓度呈曲线负相关（图8b）。这些数据与非竞争性抑制模型一致，其中SAM 的Km 为20.17 M。这些结果表明38的结合不与SAM竞争，从而阻止烟酰胺的结合，并且NNMT催化烟酰胺的甲基化。在SAM 存在的情况下将38 与NNMT 对接表明38 与SAM 磺酸盐的甲基C-H 形成显着的氢键（图7）。这种相互作用可能使抑制剂相对于SAM 保持在一个位置，从而阻止SN2 反应和甲基转移所需的180 几何形状。图8说明了这种结合模式，涉及抑制剂的吡啶氮和SAM的甲基磺酸盐之间的氢键。这也与SAR数据一致，SAR数据显示碱性吡啶氮是效力所必需的。

图7.38（绿色，PDB：5YJF）烟酰胺结合袋内的分子对接显示与SAM（蓝色）形成氢键，导致非竞争性抑制。

图8：化合物38的IC 50 作为天然底物浓度的函数。 (a) 烟酰胺浓度与38 IC50 的竞争性抑制曲线。 (b) 非竞争性抑制曲线显示SAM 浓度与38 IC50 之间的反比关系。

化合物38的临床前研究。基于化合物38良好的靶点结合和PK特性，设计了体外实验以确定其安全性、选择性和其他特性（表3）。

表3. 化合物38 的临床前研究。

化合物38具有良好的溶解度，并表现出良好的膜渗透性，在Caco-2双向实验中流出比接近1。该化合物还具有优异的口服生物利用度。这个数字是根据1mpk IV 和50mpk PO 暴露计算的，因此计算结果超过100%。化合物38 具有低血浆蛋白结合性并且无诱变性。 AMES 测试显示所有菌株的F 值均可接受。化合物38对hERG和细胞色素无明显抑制作用。体外脱靶活性筛选组显示，浓度为10 M 时，活性抑制率低于50%。已知小分子甲基转移酶(SMMT) 的活性在1 M 浓度下不超过50%。有趣的是，44 在1 M 浓度下抑制70% 的组胺甲基转移酶活性。

结论NNMT 已成为多种人类疾病的调节因子，包括饮食引起的肥胖和癌症。在癌症中，已发现维持癌症相关成纤维细胞状态有助于高级别浆液性癌中的肿瘤生长和转移，并且代表了未满足的医疗需求。这表明NNMT 抑制剂可能重塑肿瘤微环境，并且可能作为单一药物有效或增强当前治疗（包括免疫治疗）的活性。评估这些治疗机会需要强大的选择性化学探针，具有优异的体内特性，包括良好的药代动力学和靶向性。现已鉴定出一种高效且选择性的氮杂二氢吲哚甲酰胺38。它具有良好的药理特性，是一种可靠的体内探针分子。化合物38 还具有良好的初步安全性，表明它具有进一步候选开发和研究所需的特性。 38 的对映选择性合成也已开发出来，可以缩小到至少几分克。从机制上讲，38 已被证实与烟酰胺竞争，而不是与SAM 竞争。这表明38 与烟酰胺结合位点结合，并且该结合需要SAM 的存在。对接研究表明，38 和SAM 的甲磺酸偏离180，降低了38 的SN2 甲基化。相反，吡啶氮可能与SAM 的甲磺酸形成氢键，迄今为止获得的所有SAR 都支持这一点。 38有望成为体内NNMT的有用化学探针，并且它或相关类似物可能会作为化合物出现，用于测试NNMT抑制剂在人体中的治疗潜力。 1、药都CyberSAR结合药物设计思想，挖掘文献和专利报道的活性结构。通过CyberSAR，研究人员可以轻松快速获得感兴趣的目标结构以开发想法。本文中包含的烟酰胺N-甲基转移酶的示例包括：

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