嵌合抗体的制备流程，嵌合抗体名词解释
chanong
|tau 抗体的嵌合会改变其电荷和结合，从而降低细胞摄取和功效
前言：
Tau 抗体是一类用于研究和检测tau 蛋白的抗体。我们发现tau 抗体被神经元吸收及其有效性高度依赖于抗体的电荷。此外，tau 毒性和抗体阻止tau 病理学传播的能力不一定共存。
值得注意的是，4E6 的嵌合将其电荷从6.5 增加到9.6，从而阻止了人类和小鼠细胞对其的摄取。此外，尽管结合位点完整，但与鼠抗体相比，h4E6 的结合发生了改变。这些特性、吸收和结合的变化会显着降低其有效性。它可以有效防止tau 毒性，但在某些条件下也可以防止tau 病理传播。
抗体Tau 单克隆抗体4E6、1B9 和2C11 是我们实验室使用GenScript Inc. 的服务生成的。使用对应于以下磷酸化表位的肽对野生型BALB/c 小鼠进行免疫：cTDHGAEIVYK (pS) PVVSGDT (pS) PRHL (4E6 - p396/404);cPGSRSR(pT)P(pS)LP (1B9-p212/214) );IG(pS)TENLKHQPGc(2C11-p262)。该肽通过半胱氨酸残基附着在匙孔血蓝蛋白上。从具有适当免疫反应的小鼠中制备杂交瘤，并使用低内毒素版本的Protein A 亲和柱纯化抗体。测试了抗体与靶表位的结合、组织学染色和免疫印迹（1B2 和1C9 参见补充图2 和11，4E6 的表征参见补充图2 和11，[7,8,12]）。市售抗体用于蛋白质印迹和免疫细胞化学实验。 NeuN (RRID: AB_10807945)、Pan-tau (RRID: AB_10013724) 和pSer199 多克隆一抗购自Millipore、Dako 和ThermoFisher。
4E6人嵌合单克隆抗体小鼠单克隆抗体的表达和纯化通过GenScript对4E6进行测序，并将4E6重链和轻链可变结构域克隆到含有人IgG1恒定结构域的pVRC8400哺乳动物表达载体中。将含有重链和轻链的质粒瞬时共转染到含有293% PenStrep 的DMEM 培养基中的5F 细胞中。表达5天后，通过离心和0.22m过滤使上清液澄清。使用低内毒素版本的蛋白A 亲和层析分离嵌合4E6，并使用尺寸排阻层析进一步纯化。我们最近报道了这种人嵌合抗体的晶体结构。
原代神经培养物如前所述，从第1 天JNPL3 幼崽的皮层和海马体中制备神经元培养物[7, 8]。所有缓冲液和培养基成分均购自Invitrogen。简而言之，用缓冲液洗涤组织，然后与胰蛋白酶在20C 下孵育37 分钟。然后在机械分离之前进一步清洁组织。将样品轻轻离心以去除碎片，并将其添加到含有电镀介质的孔中。 24小时后，将铺板培养基更换为神经基底培养基。然后让培养物恢复7 天，然后用于实验。
蛋白质印迹蛋白质印迹按照[7]的描述进行。将细胞溶解在250 l RIPA 缓冲液中，测定总蛋白浓度并相应标准化。由同一动物制备的未经处理的对照样品在每个实验条件下在相同的凝胶上进行电泳，作为内部对照。所有样品均用O+ 上样缓冲液（62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)、5% 甘油、5% -巯基乙醇、2.3% SDS、1mM EDTA、1mM 乙二醇双(2-氨乙基)四乙酸(EGTA) 洗涤）、1mM PMSF、1mM NaF、1mM Na3VO4 和1g/ml 完全蛋白酶抑制剂混合物（Roche Applied Sciences））并煮沸5 分钟。细胞裂解物在12% 聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后转移到硝酸纤维素膜上。为了进行抗体表征，使用Superblock (Invitrogen) 中1:1000 稀释度的1B9 和2C11 在4C 下过夜探测印迹。使用HRP 缀合的小鼠二抗，以1:5000 稀释，在室温下1 小时。
PHF 和mAb 实验使用针对神经元标记NeuN、总tau (Dako) 和Ser199 tau (Invitrogen) 的兔抗体以1:1000 稀释在SuperBlock (Invitrogen) 中进行探测，并在4C 下印记过夜。为了减少变异性，每个实验均使用从同一动物制备的细胞进行。将膜在HRP 标记的兔二抗(1:5000) 中室温孵育1 小时。在所有实验中，化学发光信号均使用Fuji LAS-4000 进行可视化，并使用Multigauge (RRID: SCR_014299) 进行定量。当检查4E6、cat4E6、1B9、2C11 或Tau-5 的细胞内水平时，如上所述进行印迹和封闭。随后在按1:1000 稀释的HRP 偶联小鼠二抗中孵育过夜。然后清洗印迹并使其显色，无需进一步添加抗体。
为了比�**叩阌〖Ｐ∈蠖褂�4E6、1B9、2C11 和Tau-5 的结合，将等分试样以200 mg/ml 点样到硝酸纤维素膜上。然后将膜用TBS-T 中的5% 牛奶封闭，并在1:5000 稀释的HRP 偶联小鼠二抗(ThermoFisher) 中孵育过夜。用TBS-T 洗涤印迹并使用Fuji LAS-4000 显色。为了比较4E6 和cat4E6 之间或4E6 和h4E6 之间的比较，将连续稀释的抗体（1 mg/ml、0.25 mg/ml、0.062 mg/ml）点样到膜上。然后将膜封闭并酌情在HRP 缀合小鼠(ThermoFisher) 或人类(Abcam) 协助下孵育。所有免疫印迹和ELISA 实验均使用相同的二抗。 4E6 和h4E6 印迹膜与不同的二抗一起孵育，但一起清洗和显影，以尽量减少处理差异。
免疫组织化学对于摄取实验，将额外的神经元培养物接种到盖玻片上。用高碘酸盐-赖氨酸多聚甲醛(PLP) 固定细胞并用总tau 抗体染色。使用两种荧光标记的二抗（用于总tau 检测的兔多克隆抗体和用于4E6、1B9、2C11 和tau-5 检测的单克隆小鼠单克隆抗体）。使用Nikon Eclipse Ti 共焦显微镜以40 倍放大倍数对盖玻片进行成像。对于抗体表征实验，使用先前描述的方法对AD 脑组织进行1B9 和2C11 染色[58]。将石蜡包埋的切片安装在明胶包被的载玻片上。为了除去石蜡并暴露表位，将载玻片浸入二甲苯中，然后浸入一系列乙醇浓度逐渐降低的溶液中。
将载玻片在柠檬酸盐缓冲液（10mM 柠檬酸，0.05% Tween 20）中煮沸，并在80% 甲酸中孵育。然后将载玻片封闭并与一抗(1:200) 在4C 下孵育过夜。然后洗涤载玻片并在室温下与HRP 缀合的小鼠二抗一起孵育30 小时，并与亲和素过氧化物酶溶液一起孵育0 分钟。随后，用2.5000 M乙酸钠溶液洗涤载玻片，然后与二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)和硫酸镍铵溶液反应以显现抗体染色。使用浓度不断增加的乙醇和二甲苯对样品进行脱水，并使用DEPEX 封固剂盖玻片。使用Leica DM B 显微镜收集图像。
活细胞成像原代神经元培养物在玻璃底板中生长，并与1 g/ml Cypher 6 标记的未修饰或人嵌合5E4 一起孵育24 小时。 Cypher 5 标签对酸敏感，并在酸性区域（例如内体和溶酶体）中发出荧光。使用Axio Observer 倒置共焦显微镜以20 倍放大倍数收集图像。如上所述制备神经母细胞瘤细胞并与20g/ml Cypher 6标记的未修饰的或人嵌合5E4一起孵育3小时。然后使用API DeltaVision 个人DV 显微镜收集图像。
共焦图像的量化通过分割颜色通道将4E6、1B9、2C11 和Tau-5 摄取实验的图像导入Image J (RRID: SCR_003070)。然后使用共定位查找宏计算每个图像中在两个通道（总tau 和抗体）中都有信号的像素百分比[14,59,60]。对于实时成像实验，将每个图像导入Image J。调整阈值，直到荧光信号突出显示，并确定每个图像中抗体信号占据的像素区域的百分比。该方法用于原代神经元和神经母细胞瘤细胞。
将每种tau 抗体的等电聚焦等分试样添加到IEF 样品缓冲液中，并根据制造商的说明在预制3-9 IEF 凝胶(BioRad) 上运行。电泳后，将凝胶置于室温下的20% 考马斯蓝溶液（50% 甲醇，50% H2O）中。然后将凝胶在50% 甲醇、40% H2O 和10% 乙酸溶液中脱色，直至条带可见。酶联免疫测定法在这些实验中使用了两种不同的ELISA 测定程序。首先，将板每孔涂上1 g 靶标（tau 或从人脑中分离出的tau 肽），并在冰箱中过夜。人tau 结合测定使用源自可溶性tau 和肌氨酰不溶性tau 组分以及可溶性PHF 的蛋白质。
在其他实验中，将含有磷酸化Ser396/404 或其未磷酸化版本的C 端区域的肽包被到板上。然后使用Superblock (ThermoFisher) 封闭板30 分钟，然后将每种抗体的系列稀释液添加到板中，然后孵育2 小时。用TBS-T洗板，加入二抗（1:5000）、小鼠（Thermo Fisher）或人（Abcam），孵育1小时。进一步洗涤后，使用TMB 过氧化物酶(ThermoFisher) 使板显色，用2M 硫酸终止，并在BioTek Synergy 2 读板器上读数。对于竞争性ELISA 测定，选择单一浓度的抗体，并与浓度逐渐增加的可溶性PHF 一起孵育30 分钟，然后添加到测定板中。其余步骤与非竞争性ELISA 相同。
统计分析在GraphPad 7 (SCR_002798) 中进行统计分析。对于所有PHF 和抗体实验，将经过处理的样品与从同一动物制备的未经处理的对照细胞进行比较。双向方差分析用于LDH、NeuN 和Tau 种子实验以及使用Dunnett 多重比较测试的事后测试。当比较正常嵌合体4E6和阳离子化嵌合体4E6或正常嵌合体4E6和人嵌合体4E6的摄取时，使用双尾t检验来确定显着性。由于包含多个组，仅在第7 天（#）在未治疗组和PHF 治疗组之间进行统计分析，以验证PHF 毒性/tau 传播、仅用PHF 治疗或与PHF 一起治疗。在第7 组之间进行统计分析。各个抗体之间。
结论：我们实验的一个重要发现是，抗体功效不仅取决于它识别的表位，还取决于抗体上的电荷，这会影响神经元对抗体的摄取。另一个重要发现是抗体在防止毒性和传播方面效果较差。各方面的影响没有必然的联系。第三个重要发现证实了我们之前的结果，即聚集的tau蛋白的强亲和力与疗效无关，所有这些都支持正在进行的tau蛋白免疫治疗临床试验和临床候选药物的鉴定，这对筛选方法的有效性具有重要意义。人源化tau 抗体在临床试验中尚未得到很好的表征，这些发现引发了人们的主要担忧，即它们的特性可能与小鼠对应物存在显着差异，并且它们的功效可能存在显着差异。