蛋白质双向电泳一般是哪两种电泳的结合，蛋白质双向电泳的基本原理
chanong
|二维蛋白质电泳是一种结合蛋白质的等电点和分子量两个特征来分离蛋白质的技术。二维蛋白质电泳的第一维是等电聚焦（IEF），根据蛋白质等电点的不同来分离蛋白质，第二维是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将各个分子分离（SDS-PAGE）。将子单元的重量除以大小。两次分离电荷和分子量可提供蛋白质分子的等电点和分子量信息。简而言之，第一步是等电聚焦，其中蛋白质沿着pH梯度分离到它们各自的等电点，然后它们的分子量沿着垂直方向分离。
第一维（等电聚焦，IEF）
1. 凝胶条的制备
将四根玻璃管分别放入两个凝胶灌注装置中，使凝胶帽（两个校准环：4 mm 和10 mm）的末端朝下，并且玻璃管准确地立在两个隔室之一中。插入支架。 ”。将PP 线从玻璃管的顶部拉到玻璃管的底部（小心，因为线不会轻易移动）。否则以后就无法用它来拉胶液了。
溶解分离胶溶液和过硫酸铵溶液。必须监测凝胶溶液的温度，因为聚合反应在高温（高于25 C）下快速进行。
将分离胶溶液脱气4分钟，并用桌子边缘轻弹玻璃管壁，以避免气泡。
溶解并脱气盖凝胶溶液，并按照与步骤3 相同的程序进行操作。
使用Gilson 移液器将35l APS 添加到1365l 分离凝胶溶液中。必须小心摇动溶液以防止氧气进入凝胶。
将分离胶溶液添加到两个凝胶填充装置的每个填充舟中（每4管700l）。所有玻璃管的末端必须浸入凝胶溶液中。
小心地拉出PP线并将凝胶溶液拉至23毫米标记处。
更换船舶的加油舱。
使用Gilson 移液器，将10 l 0.8% APS 添加到390 l 封盖凝胶溶液中，并通过轻轻涡旋混合。
将200 l 盖凝胶溶液添加到两个凝胶灌注装置的每个填充舟的空室中；凝胶溶液应达到17 mm 标记。
取出填充船并等待凝胶溶液达到13 mm 标记。完成此步骤后，空气将进入管底部和4mm 标记。
聚合30分钟后，拔出PP线，除去凝胶表面未聚合的溶液。在毛细管口加入一大滴去离子水，在凝胶上方形成一个湿润室，并在凝胶和水滴之间产生气泡。使用此方法创建湿室，然后用封口膜密封盖凝胶侧。通过将凝胶在室温下放置过夜可以实现进一步的聚合。如果在室温下保存，制备好的试管可在第二天使用，或者最迟在制备后5 天使用。
2.添加样本
将乙二胺加入到阴极电解液中，脱气5分钟，然后将阴极电解液充满下槽。
溶解Sephadex 溶液，将108 mg 尿素和10 l 两性电解质混合物添加到100 mg Sephadex 凝胶中，并用涡旋器彻底涡旋10-15 分钟。
将凝胶管从注胶装置中取出，插入聚焦槽的阳极部分，13mm 标记仍可见。盖住凝胶末端。
将阴极电解液添加到管的阴极侧，不要产生气泡（水已预先除去）。
聚焦槽的阳极部分应放置在聚焦槽的底部，管子应浸入阴极溶液中。
排干水并干燥装载表面。使用加长巴斯德移液器或填充凝胶的移液器吸头除去水，并用滤纸条擦干凝胶表面。
解冻准备好的样品和覆盖溶液。
将凝胶充满移液器吸头，并快速用约2 mm 厚的Sephadex 覆盖凝胶。
用凝胶填充移液器吸头，上样（1-15 l），并将其添加到Sephadex 表面。添加样品时，吸头应与头孢地斯表面接触，并小心添加样品，避免产生气泡。
使用填充凝胶的吸头，轻轻地将5 l 覆盖溶液添加到样品上并分层，不要混合覆盖溶液和样品。接下来，将阳性溶液添加到毛细管中以避免气泡。
将剩余的阳极电解液添加到上罐中，并用缓冲液覆盖所有管。
3.等离子电泳
凝胶平衡
解冻平衡溶液（IEF 结束前1 小时）。使用前将0.2 g DTT 添加到20 ml 平衡溶液中。
IEF 完成后，从管中取出正溶液和负溶液。
用87% 甘油溶液覆盖盖凝胶侧。
将5 ml 平衡溶液添加到培养皿中。
用PP线推出凝胶：将PP线穿过盖子的凝胶侧，将管的样品侧浸入去离子水中，小心地向下推动凝胶。同时，可以看到水中的涂层液溶解。 5分钟后抽出凝胶，迅速用水清洗挤压端。接下来，将管子放在含有平衡溶液的培养皿上，并通过PP 线将整个凝胶拉入培养皿中。您可以平衡每个板上的两种粘合剂。
在室温下摇动10 分钟以平衡凝胶。 IEF 后，如果不立即使用凝胶，应倒出平衡缓冲液并储存在培养皿中-70 C。 -20C 储存会降低分辨率，液氮储存会破坏凝胶。第二维（SDS-PAGE） 1. SDS-PAGE 凝胶的制备将琼脂糖溶液加热至70使其液化。将琼脂糖溶液冷却至40C，使其保持液态。喷洒70% 乙醇并用Kimwipe 刷洗玻璃板和隔板。溶解凝胶溶液和APS。将玻璃板夹到夹紧装置上。该夹紧装置放置在灌装台的前槽中，旋钮面向灌装台且“尖端”朝上。将旋钮旋转得足够远，使厚有机玻璃与后边缘完全对齐。这时可以在有机玻璃板前面放置一块大玻璃板，并在左右边缘设置隔断。插入小板，用拇指轻轻按压玻璃板和垫片，确保玻璃板位于底部。用钳子夹住准备好的“三明治”，当后端出现牛顿环时，旋钮就被拧得很紧了。请小心不要过度用力转动旋钮，否则玻璃板可能会被压碎。将三明治从支架中取出，并用拇指确保玻璃和隔板与底部齐平。标记距小玻璃板底部172.5 像素的位置，以帮助添加样品（凝胶长度为165 像素）。将凝胶“三明治”装置夹在填充架上，旋钮向内，“点”向上。对有机玻璃板施加压力，并将凝胶三明治插入小突起下方。混合18ml 凝胶溶液和1.2ml APS，不要产生气泡。必须在不引入氧气的情况下混合溶液。将盛有凝胶溶液的容器放在添加槽后面的玻璃板上，凝胶溶液会沿着添加槽顺着玻璃板流下，无气泡，分离胶将添加到标记位置。快速用去离子水覆盖凝胶溶液，以促进聚合并使表面平坦。用巴斯德吸管移至凝胶一端，防止凝胶溶液搅动，确保水均匀地分层在凝胶表面。 60 分钟后，凝胶即可用于SDS-PAGE 电泳。 2. 加入样品，用滤纸条除去凝胶表面的去离子水。将凝胶“三明治”放在电极装置上（旋钮向外，尖角朝上）：首先，将凝胶“三明治”放在电极装置顶部，然后将其朝电极装置按压以固定底部。将IEF 凝胶添加到平坦的凝胶表面。从平衡缓冲液中取出凝胶条，将其纵向放置在厚有机玻璃板的边缘上，确保凝胶条尽可能靠近凝胶边缘。样品添加罐。使用小抹刀轻轻向下推凝胶条并小心地将其滑入样品槽中。凝胶条应位于SDS-PAGE 表面，没有任何气泡。用巴斯德移液器向取样罐注入40的琼脂糖溶液（无气泡），2分钟后琼脂糖溶液凝固。将电极装置连接到凝胶“三明治”后，用620 ml 电极溶液填充BioRad 罐。添加溶液时注意不要产生气泡或气泡。内槽中的电极缓冲液液位应达到电极装置上红色塑料点的位置。 3、密封槽进行SDS-PAGE电泳前，需要检查有机玻璃表面是否干燥，避免形成“渐进”电流，并且凝胶表面必须涂有电极缓冲液。电压应按下表逐步升高，电流和功率应调整至电源的最大值。当前值如表中所列，并在每个部分内逐渐减小。 SDS-PAGE 后，倒出电极缓冲液，并从电极装置中取出凝胶“三明治”。稍微弯曲隔板并拉开小玻璃板以除去凝胶。可将凝胶转移至固定液中。固定后，可以使用多种染色方法。预防
样品前处理是二维电泳的关键。等电聚焦的样品需要去除盐离子、染料、酚类、核酸等，并添加抑制剂以防止蛋白质降解，所以根据样品的不同，需要进行样品前处理，需要参考资料。聚焦的质量还与两性电解质的质量有关。