帕金森小鼠模型建立，帕金森小鼠造模成功标准

引自《上海中医药杂志》编辑部2022-07-05 07:00 上海发表

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，根据临床症状可分为震颤型、强直/活动减退型和混合型。其中，补药PD对左旋多巴制剂较不敏感，容易出现各种并发症。近期临床研究表明温阳活血方可改善僵硬性PD患者的临床症状和生活质量，但其具体作用机制尚未阐明。因此，构建阳虚瘀证帕金森病模型及其评价体系，对于中药防治补虚帕金森病的研究具有重要意义。相关研究中，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的慢性PD小鼠出现了明显的肌肉僵硬症状，如运动迟缓、卷曲等。这项研究。实验小鼠建模。基于中医证候动物模型的建立和评价标准以及中医方证检验的原则，MPTP诱导的慢性

确定PD小鼠模型的中医证候特征。

材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物SPF级C57BL/6健康小鼠，50只，雄性，8周龄，体重（252）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK（上海） ）2017-0005，实验动物的饲养和观察在上海中医药大学实验动物中心进行，实验动物使用许可证编号：SYXK（沪）2020-0009。小鼠健身：饲养1周，自由进食和饮水，室温（232），相对湿度（5510）%，12小时光/暗循环，自由进食和饮水。本实验动物的饲养和操作符合上海中医药大学实验动物伦理委员会的相关批准（伦理守则：

PZSHUTCM200717037）。

1.1.2 药物和试剂MPTP（批号：M0896-100MG）、TH（批号：sc-25269AC），美国Sigma公司，环磷酸腺苷（cAMP）试剂盒（批号：EM3362M），环磷酸鸟苷（ cAMP)环鸟苷单磷酸（cGMP）试剂盒（批号：EM3363M）、血栓素A2（TXA2）试剂盒（批号：EM3421M）、前列环素（PGI2）试剂盒（批号：EM3421M），上海维奥生物科技有限公司；

GAPDH（批号：60004-1-1g），美国Proteintech公司。

1.1.3 主要设备：F106医用额温计，宁波上村电子有限公司，Synergy 2多功能酶标仪，美国BioTek公司，RM2016病理切片机，上海徕卡仪器有限公司，043BR41664西电电泳仪及水平仪电泳槽，美国BioRad公司；MoticSMZ-171体视显微镜，厦门麦奥迪电气有限公司，OdysscyCLx近红外二色荧光成像系统，美国LI-COR公司。

1.2 分组与建模适应性喂养1周后随机选取50只C57BL/6小鼠。

10只小鼠作为正常组，其余40只小鼠腹腔注射MPTP建立PD模型。建模方法：将MPTP溶解于0.9%氯化钠溶液中，腹腔注射，剂量为25 mg/kg，每周两次，与丙磺舒（250 mg/kg）联用，以减缓MPTP的代谢清除，持续5周。共注射10次。非模型动物灌胃等体积0.9%氯化钠溶液5周。模型复制成功后，采用随机数字表法将40只小鼠分为模型组、六味地黄汤组、金匮肾气汤组、芪鸡术掌汤组。 MPTP注射后小鼠出现强直症状

研究中药方剂对帕金森病小鼠僵硬症状的影响，几小时后逐渐恢复正常。

因此，在为期2周的草药干预后的第一天，给小鼠腹腔注射少量15 mg/kg MPTP以诱导出现僵硬症状。

图1 病证复合型帕金森病小鼠模型构建过程

1.3 干预方法六味王汤和神庆神器汤的组成和用量均遵循《处方》。

“学**”是为了兼容。六味九王汤（巨根、山茱萸、山药、天南星、芍药、茯苓）、金惠新气丸（九王、山茱萸、山药、天星、芍药、茯苓、肉桂枝、虎苓）、芪积树煎汤（黄芪、狗背） 、槐花、桃仁、当归、小米、木瓜、威灵仙、广鸡龙、白芍、厚朴、草坪草），以上药材均由上海雷云祥药材有限公司提供，本人。将上述药物用冷水浸泡30分钟，煮沸两次，每次30分钟，过滤，药液合并，浓缩。小鼠每日灌胃剂量按照人和动物体重当量剂量换算法换算，三种药物的灌胃剂量为换算后药物剂量的6倍，按下式计算：153.12g·(kg·d) - 1.六味地汤：67.58g·(kg·d) - 1.金桂金七七汤：73g·(kg·d) - 1.根据体重同时灌胃计算用量时，正常组和模型组均灌胃0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续2周。

1.4 检测指标及检测方法

1.4.1一般体征观察观察并记录各组小鼠的一般体征。

1.4.2 体温测量在室温（202）的动物房中，在最后一次MPTP诱导后2和4小时用红外温度计测量额头温度。 PD 小鼠的僵直症。红外测温枪测量的最低温度为32，因此如果小鼠体温低于该温度，则测量3次，记录平均值。

如果温度为32，则按32计算。

1.4.3行为测试（1）撑杆测试：记录各组小鼠治疗后掉头时间和完成攀爬的时间，每只小鼠测试3次，取平均值作为最终结果。 (2)刚度评分测试：将小鼠保持在固定位置，将小鼠前肢放置在距水平面高4厘米、宽1厘米的木条上。使用秒表记录动物保持该姿势的时间，当两只前爪离开杆或当动物探索性地移动头部时停止。截止时间为300 秒。每只小鼠测试3 次，每次间隔1 分钟。如果小鼠保持该姿势超过30秒，则判定为僵硬，并根据时间进行评分，0秒记为0分。

1秒至150秒得1分，151秒至300秒得2分。

各组小鼠在造模前均进行连续3天的行为训练。僵直评分的测试时间为MPTP 诱导PD 小鼠僵直后4 小时。爬杆实验的测试时间为MPTP诱导PD小鼠僵直后4小时。

请愿第二天上午8点。

1.4.4 微舌图像的采集和分析治疗后第三天，将小鼠麻醉后，在相同光源下使用体视显微镜拍摄小鼠的舌图像。使用Adobe Photoshop 2020，将小鼠舌头图像分成5等份，定量分析舌头图像的中央l/5区域，读取R1、G1、B1的值，并计算总和。测量R1+G1+B1，R 表示红色，G 表示绿色。

蓝色B 占总数的百分比。

1.4.5环核苷酸、血栓素A2、前列环素含量检测舌像采集后第1天，采集小鼠血清，采用ELISA法检测各组小鼠cAMP、cGMP、TXA2、PGI2含量。 cAMP/cGMP 和TXA2/PGI2 比率。

1.4.6 多巴胺能神经元损伤评价小鼠采血后，摘除大脑纹状体部分，采用Western blotting检测小鼠纹状体中酪氨酸羟化酶（TH）蛋白的表达水平。灌注后收获小鼠全脑，固定于4%多聚甲醛中，梯度脱水后切片，收获小鼠黑质层进行免疫组织化学（IHC）检测阳性TH+多巴胺能神经元细胞的检测。

1.5 统计方法实验数据采用GraphPad Prism 8软件进行统计处理。测量数据以xˉs表示。使用单向或双向方差分析分析多个数据组。 P0.05被认为有统计学上的显着差异。

结果

2.1一般体征观察：正常组小鼠皮毛整齐、有光泽，反应灵敏，精力充沛。

精神状态良好，动作良好，大便呈颗粒状。 MPTP注射后2小时，模型组和六味-利曼氏菌组小鼠出现运动缓慢、肌肉僵硬、蜷缩、四肢颤抖、疲倦无力、肿块肿块、便溏等症状。金桂神七汤组和七治清酒组

小鼠上述表现较模型组明显改善。

2.2 小鼠体温结果如图2A所示，MPTP给药后，与正常组相比，

模型组注射后2、4小时体温明显下降，差异有统计学意义（P<0。05）；与模型组比较，金匮肾气汤组、芪蓟疏章汤组体温下降注射后体温升高。 2、4 h后，六味地黄汤组、金匮肾气汤组、芪鸡疏掌汤组小鼠体温均明显升高，差异有统计学意义（P<0。05）。此外，芪鸡舒张汤组对小鼠体温的改善作用也表现出良好的效果。

金匮肾气汤组比较，差异有统计学意义(P<0。05)。

2.3 行为学结果MPTP给药后，模型组僵直程度较正常组减轻。

与模型组相比，运动量显着增加，运动量包括冻结、转头、爬杆所需时间显着减少(P<0。05)。六味地黄汤组小鼠各项指标无显着性差异（P0.05）；金匮肾气汤组和芪鸡疏掌汤组小鼠各项指标均有改善，且芪鸡疏掌汤改善了行为表现。小鼠的效果优于金匮肾气汤，且差异有统计学意义。

学术重要性（P0.05）。参见图2B、2C和2D。 A：各组小鼠体温变化，B：各组小鼠僵硬评分，C、D：各组小鼠爬杆实验结果。

与正常组比较， *P0.05, 与模型组比较， #P0.05, 与金匮肾气汤组比较， P0.05

图2 小鼠体温和行为结果（n=10）

2.4 小鼠微舌外观及舌色度值分析结果通过对舌色度值的分析，我们发现与正常小鼠相比，

与正常组小鼠相比，模型组舌色R、G值比值降低，B值比值升高(P<0。05)。治疗后，与模型组比较，金匮肾气汤组、芪鸡舒壮汤组小鼠舌色R值比值升高，B值比值降低(P<0。05)。

所占比重有所增加(P0.05)。参见图3。 A：各组小鼠舌头外观，B：各组小鼠舌头颜色R值比例，C：各组小鼠舌头颜色G值比例，C：比例各组小鼠舌色G值，舌色G值比值。

D：各组小鼠舌色B值的比值。与正常组比较*P0.05，与模型组比较#P0.05

图3 各组小鼠舌外观及舌色值分析（n=10）

2.5 血清环核苷酸、血栓素A2、前列环素含量检测结果与正常值不同

与其他组比较，模型组小鼠血清cAMP/cGMP比值显着降低(P<0。05)。治疗后，与模型组比较，金匮肾气汤组、芪鸡疏掌汤组cAMP/cGMP比值升高，差异有统计学意义(P<0。05)。此外，与正常组相比，模型组TXA2/PGI2比值显着升高(P<0。05)。中草药干预2周后，芪鸡舒张的TXA2/PGI2比值较模型组有所升高。汤剂组减少，差异有统计学意义(P<0。05)。参见图4。

A：小鼠血清cAMP/cGMP 比值，B：小鼠血清TXA2/PGI2 比值。 *与正常组相比，P0 .05，与模型组相比，#P0 .05

图4 小鼠血清cAMP/cGMP、TXA2/PGI2比值(n=5)

2.6 多巴胺能神经元损伤评价结果免疫组化结果显示，与正常组相比，

相比之下，模型组小鼠黑质致密部TH+阳性多巴胺神经元细胞数量减少(P<0。05)。中药干预两周后，小鼠较模型组有所减少。敬业参芪汤组和芪鸡熟肉汤组小鼠黑质致密部神经元含量增加，且与敬业参芪汤组相比，芪鸡熟肉组小鼠黑质致密部TH+含量增加。阳性多巴胺神经元增加。汤剂组显着升高(P<0。05)。与正常组比较，模型组小鼠体内TH蛋白表达显着降低(P<0。05),且用药干预2周后，六味地汤组与模型组无显着差异。组。我不能。 (P<0。05)),金匮肾气汤组、芪积救壮汤组显着高于模型组，芪积酒汤组显着高于模型组。

詹汤组TH蛋白表达量显着高于金匮肾气汤组(P<0。05)。参见图5。

A、B：各组小鼠纹状体中TH蛋白的相对表达量；C、D：各组小鼠黑质致密部神经元的表达量。与正常组比较，*P0.05；与模型组比较，#P0.05；与金匮肾气汤组比较，

0.05比索

图5 小鼠黑质致密部和纹状体多巴胺神经元丢失评估（n=3）

讨论

PD是临床常见的神经退行性疾病，病理生理复杂，治疗效果不理想，给患者和家庭带来很大负担，因此特别需要寻找更好的治疗方法。中医药治疗PD具有很大优势，不仅可以直接改善临床症状、延缓病情进展，而且可以与西药协同解毒。由于PD患者大多有明显的震颤症状，故中医常将PD归为“震颤证”。对PD的研究逐渐深入，发现1/3的PD患者以肌肉僵硬为首发症状，而僵硬的PD比以震颤为主要症状的PD造成更多的残疾。发病率很高，严重影响患者的生活质量。目前，关于刚性PD的研究较少，但直到2003年，中医名称刚性PD才被首次提出并纳入“疾病”范畴。这种疾病的类型和治疗仍然未知，也没有得到很好的讨论。辨证论治是中医药发挥疗效的基础。

病因学：我们课题组根据多年的临床及文献研究认为，阳虚血瘀是本病发生发展的关键。

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利用该机制构建阳虚血瘀证PD模型及其评价体系具有重要意义。

目前常用的病证结合动物模型制作方法有以下三种：首先构建疾病动物模型，然后应用中医病机发展相应的证候；建立疾病模型，建立疾病动物模型。根据中医病因，制定相应的中医证候；根据疾病动物模型的辨证，建立病证复合型动物模型。本实验采用的第三种方法是利用MPTP建立PD小鼠动物模型并对其进行分化。使用MPTP对小鼠造模5周后，模型组小鼠出现了与PD患者类似的肌张力、运动迟缓、震颤、驼背不动、弓背、四肢震颤等运动迟缓症状。肌肉僵硬、运动迟缓更加明显，病理结果显示模型组小鼠黑质和纹状体中TH含量显着降低，小鼠脑内MPTP显着降低，提示可能造成多巴胺神经元并诱导小鼠僵住症状。

我们的结果表明，这种建模方法成功地创建了僵直性PD小鼠模型。

为了研究PD小鼠的证候特征，本研究以郑晓伟提出的中医动物模型为建模基础，重点从四个方面（模拟发病机制、模拟症状、客观指标、药物（反佐剂））进行研究。

慢性帕金森病小鼠模型中综合征属性的测定。

首先，MPTP是一种神经毒素，作用于多巴胺（DA）神经元，穿过血脑屏障，产生代谢物MPP+，抑制线粒体呼吸链复合物I的活性，抑制ATP的产生，导致活性氧的减少和异常积累。导致多巴胺能神经元死亡。 MPTP 导致帕金森病的一个重要机制似乎是ATP 产生的减少。研究表明，阳虚动物模型中ATP含量显着降低，导致能量代谢水平降低。阳虚有密切关系。由于阳虚症状与基础代谢率下降、能量代谢减少、产热不足等症状密切相关，因此可以用MPTP来模拟阳虚的原因。阳虚者，不能行血，久而久之，出现血瘀，故本实验采用长期给药。

模拟阳虚瘀滞病机的方法。

其次，在模拟症状方面，每次给小鼠腹腔注射MPTP时，小鼠行动缓慢，蜷缩，驼背，肌肉僵硬，四肢颤抖，疲劳无力；表现出打捆、肿胀、垂尾等现象。症状与PD 患者相似，包括肌张力、运动迟缓和震颤。肌张力和运动迟缓比震颤更明显。上述症状在注射后2小时最为严重，随后逐渐减轻直至消失。我们在分析小鼠舌头颜色时发现，模型组小鼠的R、G值比例下降，B值比例上升，而模型组小鼠舌头颜色中红色比例增加。模特群体增加了，我发现是这样的。模型组舌质减少，紫色比例增加，与薰衣草舌的中医特征一致。此外，模型组小鼠的体温较低，粪便也较软。根据总体症状和体征可以确定是否触发MPTP。

慢性PD小鼠的证候属性为阳虚瘀血型。

核苷酸（cAMP、cGMP）作为客观指标，可以调节细胞功能，与机体神经内分泌系统的功能密切相关。正常情况下，两者保持动态平衡，但阳虚时，cAMP降低，cGMP升高，cAMP/cGMP比值降低。这两者的比例变化常被作为判断色光的重要指标之一。中医阳虚证。 TXA2具有收缩血管、促进血小板聚集的作用，PGI2具有扩张血管、抑制血小板聚集的作用。生理状态下，它们保持相对平衡，但在血瘀证时，TXA2和PGI2之间的平衡被破坏，TXA2/PGI2比值升高。本实验中模型组小鼠血清cAMP/cGMP比值降低，TXA2/PGI2比值升高。这与阳虚瘀证的特点是一致的。

最后，为了更精准地验证MPTP所致慢性PD小鼠的证候特征，本研究采用了滋阴补肾代表方剂六味地黄汤和金匮肾气汤，并采用抗药佐剂的方法。温补肾阳的代表方剂是七季树汤，经验证具有温阳补肾、活血化瘀的功效。经过两周的中草药干预，从行为、体温、舌象、PD动物模型客观指标、中医证候属性研究客观指标五个方面进行验证。结果显示，六味地汤治疗的小鼠体温有所改善，但行为学和舌症状没有明显改善，金匮肾气汤组和芪鸡十正汤组的小鼠表现出明显的僵硬症状和舌体症状。观察到症状。运动表现、恢复情况、体温、舌症状均有改善，且七积疏壮汤组的治疗效果明显优于金匮肾七汤组。 TH是多巴胺合成的限速酶，TH含量在一定程度上反映了多巴胺神经元的数量。本研究对小鼠黑质致密部和纹状体区域的TH 含量进行了测定，结果显示模型组小鼠各区域的TH 含量均显着下降，提示MPTP导致黑质致密部和纹状体区域TH 含量减少。小鼠脑内多巴胺神经元经中药干预后，金匮肾气汤组和芪鸡疏壮汤组小鼠各区域TH含量显着高于模型组。六味地黄组无显着性差异，具有温阳活血作用的芪积疏章汤治疗效果较好，但金匮肾气组仅温阳气而无明显疗效。滋养它。在PD动物模型的客观指标方面，中药干预2周后，六味地黄组小鼠血清指标与模型组相比无显着差异。金匮肾气组小鼠增加，TXA2/PGI2无显着性差异。这就说明金匮肾气汤能够在一定程度上纠正PD 小鼠的阳虚状态，但金匮肾气组小鼠血清cAMP/cGMP 比值、芪鸡舒张组小鼠的升高以及TXA2/PGI2 的降低，研究表明具有温中活血的作用，芪鸡舒张汤可以改善PD小鼠阳虚血瘀的状况。

综上所述，本实验采用MPTP诱导的慢性PD小鼠，注射建模药物后，小鼠表现出明显的僵直症状，是一种较为理想的僵直PD模型。针对该模型的证候特征，本研究通过行为研究、客观指标检测、处方检验等方面对该模型进行了检验。

根据该证候，确定MPTP诱导的慢性PD小鼠的中医证型为阳虚瘀滞型。这种病证与动物模型的结合可以作为PD中药动物实验研究的基础工具，可为阳虚瘀血证PD模型的选择提供参考。上海薇娅生物科技有限公司

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