转基因抗虫玉米流程图，转基因抗虫玉米流程
chanong
|概括：
【目的】基因重组育种是利用生物技术，将对人类有益的外源基因整合到宿主植物的基因组中，从而使植物获得自然进化无法获得的优越性状，这就是植物的“预期效果”。外源基因的引入。然而，将外源基因插入受体植物中也会导致细胞、新陈代谢或表型发生不可控制的和预期的变化，称为“意外效应”。意外效应是转基因植物安全性评估的核心内容之一，已成为近年来的热点和难点话题。本研究以抗虫转基因玉米为材料，利用差异蛋白质组学技术，对比研究转基因玉米与其非转基因玉米的非预期效应，探讨转基因植物的非预期效应，为蛋白质组学技术提供理论参考。分析。
[方法] SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd 4个已进入中国农业部安全性评价阶段的、用苏云金芽孢杆菌（Bt）内毒素转化的抗虫玉米材料及其玉米材料基因，选择。材料郑单958和郑58在受控的人工温室中生长。当玉米幼苗生长到五叶一心阶段时，从各材料中采集生长方式相同的6株顶部完全展开的叶片，混合作为样品进行取样，并提取叶片蛋白。利用二维电泳技术，我们分离了四种转基因玉米及其相应的非转基因材料的丰富蛋白质组，并用图像扫描仪扫描了漂白的蛋白质凝胶，并用PD分析了蛋白质凝胶图案。 Quest 8.0 软件（Biorad，美国），将每个匹配蛋白的表达水平表示为蛋白点的相对体积（% Vol），并对电泳上与给定蛋白相差两倍以上相对体积的蛋白点进行采样并根据相应的蛋白质数据库进行质谱鉴定，并对鉴定出的特异性和差异性蛋白质进行细胞功能富集分析（GO）和代谢途径富集分析（KEGG），评估转基因昆虫潜在的非预期影响。抗性玉米。
[结果] 通过比较四个转基因抗虫玉米品种及其非转基因对照的富集蛋白质组，除了感兴趣的抗虫基因外，我们总共鉴定了61 个基因，这些基因主要在光合作用方面功能丰富。蛋白质被鉴定。碳固定、能量运输和其他基本细胞功能相关酶，如二磷酸核酮糖羧化酶、ATP合酶和丙酮酸磷酸二激酶。只有少数与基本代谢过程（如光合作用、碳固定和ATP 合成途径）相关的基因表现出表达增加。 KEGG分析显示，与对照ZD958相比，SK12-5zd的差异蛋白在光合生物的固碳途径中显着富集，Bt799zd的差异蛋白在固碳途径、光合作用和碳代谢途径中显着富集。丰富。每个都是光合生物。与对照Z58相比，IE034z和Bt799z中的不同蛋白在光合代谢途径中显着富集。四种转基因材料与对照蛋白质组表现出高度相似性，并且没有检测到异常基因表达。
【结论】所测试的四类转基因材料在蛋白质水平上均未出现任何可能影响其安全性的意外影响；这表明可以用来验证。
介绍
【研究意义】植物转基因技术的目标是将特定的外源基因整合到受体植物的基因组中，使其对植物本身有益或满足人类的需要，并获得该外源基因所表达的特定性状。是植物整合到其基因组中的东西。这允许稳定的继承。这些性状是转基因植物的目标性状，也称为预期效果。外源基因整合位点和外源基因产物本身的不确定性可以改变受体植物的能量和物质代谢，从而影响其天然的生理代谢过程，甚至性状发生改变。这些性状变化在转基因育种设计过程中是不可控和意外的，这种不可控和预期的性状变化被称为“非预期效应”。事实证明，转基因植物实际上是外源基因的预期目标效应与受体植物基因组因引入外源基因而产生的非预期效应的组合。转基因植物是否具有非预期效应，以及非预期效应的安全性评估，一直是科学家和公众广泛关注的话题。多年来，各国有关部委均依据经济合作与发展组织（OECD）1993年提出的“实质等同原则”对转基因植物的安全性进行评价。评价的核心是识别转基因植物与其非转基因受体植物在农艺性状、环境适应性、营养成分和物质组成变化等方面的差异，并确定是否对转基因植物产生非预期的影响，检查或排除。传统的检测方法不仅难以完全覆盖转基因植物可能产生的非预期效应，而且检测指标有限，且成本高、费时、费力。因此，建立全面、快速、准确、灵敏的检测技术是分析和鉴定转基因生物安全性的关键。
【迄今研究进展】 近年来，蛋白质组分析技术发展迅速，二维电泳技术和iTRAQ技术已成为当今蛋白质组学研究的核心技术。研究人员在蛋白质组水平上评估了转基因玉米、大米、大豆和其他成分的意外影响，并取得了积极的结果。转基因玉米商业化生产以来，已占全球转基因作物种植面积的30%，在转基因作物中排名第二。该基因是苏云金芽孢杆菌(Bt)昆虫内毒素基因(本文统称为“Bt基因”)，其是多种苏云金芽孢杆菌物种的孢子。 COLL 等人发现，使用2D 凝胶电泳和质谱分析和比较同一地块中生长的两个Bt 转基因玉米MON810 品种的籽粒蛋白质组。结果表明，转基因玉米MON810和它的非转基因对照材料几乎是等价的，ALBO等人还发现MON810和它的非转基因对照的籽粒蛋白质组之间存在意想不到的差异，我也发现了一些东西。 MON810本质上是一样的；ZOLLA等人发现，同一田地生长的MON810和它的对照是完全相同的，来自菌株的不同代材料的蛋白质组存在显着差异，并且在蛋白质组水平上，出现了意想不到的突变效应与转基因插入相比，环境因素的影响更大。上述研究结果表明蛋白质组学技术正在成为检测转基因作物非预期效应的有效方法。
【本研究要点】不同转基因Bt基因的抗虫玉米材料不仅具有明显不同的目的基因，而且由于受体材料和回交育种工艺的差异，导致抗虫玉米材料具有不同的转基因Bt构成替代玉米差异的材料存在重大差异。这些遗传背景差异是否会产生意想不到的影响仍知之甚少，目前的研究主要集中在Bt 基因对昆虫抗性目标的预期影响上。转基因抗虫玉米SK12-5、IE034、Bt799z和Bt799zd是我国自主研发的转基因新材料，有望具有产业化潜力，针对上述新材料和环境问题进行了大量的育种研究开发工作正在进行中。虽然对所得相应育种材料的安全性和食用品质进行了评价，但尚未见安全性评价研究报道。
[需要解决的重要问题] 针对上述转基因抗虫玉米，我们利用二维电泳技术对不同遗传背景的四类转基因材料进行了比较分析。在科学层面，我们预先评估了实验材料中的蛋白质水平是否会出现影响转基因材�**踩缘囊馔庥跋欤⑻峁┦葜С治颐堑钠拦馈Ｒ庀氩坏降男Ч�
1. 材料与方法
1.材质
测试材料：1#号为浙江大学提供的具有转基因cry1Ab/cry2Aj和ZD958遗传背景的杂种SK12-5zd。 2号为具有Z58遗传背景的cry1Ie自交系IE034z，由中国农业科学院提供。 3#为Z58遗传背景的mcry1Ac转化自交系Bt799z，4#为ZD958遗传背景的mcry1Ac转化杂种Bt799zd，均由中国农业大学提供。选择非转基因自交系Z58和杂种ZD958作为对照材料，分别编号为5#和6#。以2#、3#号转基因自交系为目的基因转化子，自交两代后与Z58材料回交六代，保证纯合、稳定遗传，获得具有自然背景的转基因自交系。上述所有转基因材料均采用国家公布的基因改造检测标准对外源基因进行了分子表征，证明其为独立转化事件且不向环境释放，目前正处于基因重组安全性评价的测试阶段。
2014年6月，试验材料在吉林省公主岭市吉林省农科院人工温室内种植，长至五叶一心的幼苗进行取样。最好的结果是用六株生长基本相同的植物获得的，其中上部叶子完全展开并混合作为样品。液氮冷冻后，立即用干冰运输至实验室，-80保存。
2、玉米叶总蛋白的提取
去掉叶子的主脉，切成1厘米的段。称取0.5 克叶子，加入50 毫克PVPP 并彻底研磨。添加7.5 mL 预冷至-20C 的蛋白质提取缓冲液，并在冰上研磨。置于冰冷的10 mL 离心管中，-20放置1 h，4、13,000 r/min 离心45 min，弃上清，加入7.5 mL。将蛋白提取液II 预冷至-20C，悬浮，20C 振荡1 小时，4C 13,000 r/min 离心45 分钟，弃上清，重复两次。加入7.5 mL 80%预冷丙酮完全悬浮，离心除去上清液，真空干燥沉淀，称重。每种材料重复3次，通过Bradford法[26]测定所得蛋白质浓度，并准备用于蛋白质二维电泳分析。
3. 蛋白质等点聚焦
使用24 cm 长、pH 310 线性干试纸条（Biorad，美国），使用蛋白质提取液和水合缓冲液（8 mol·L1 尿素，2 mol·L1 硫脲，4%）。集。 CHAPS，0.002%溴酚蓝，使用前与65 mmol·L-1 DTT和0.2% IPG缓冲液混合至总体积450 L（约含蛋白质1 200 g），被动水合18 h。将水合试纸条转移至等电聚焦槽中（试纸条酸性端置于聚焦盘“+”端，碱性端置于聚焦盘“-”端）。每条试条中加入3 mL 矿物油，将1/3 湿润的滤纸放在试条两端，夹住电极夹，固定聚焦盘。请参阅Biorad 产品了解等点聚焦程序和参数设置。手动的。等点聚焦后，将试纸条置于平衡缓冲液中（6 mol L-1 尿素、75 mmol L-1 Tris-HCl (pH 8.8)、2% SDS、25% 甘油、0.002% 溴酚蓝）。摇匀并平衡2次，每次15分钟。对于第一次平衡，向缓冲液中添加1% DDT，对于第二次平衡，向缓冲液中添加2.5% 碘乙酰胺(IAM)。平衡后，取出凝胶条并用平衡缓冲液轻轻冲洗以除去多余的平衡缓冲液并准备SDS-PAGE 电泳。
4.SDS页面
将平衡条放在二维凝胶上，除去气泡，使它们紧密接触，用1% 琼脂糖凝胶密封条，然后打开电源。第一步以1 W/凝胶运行1 小时，第二步以13 W/凝胶运行，直至溴酚蓝到达凝胶底部。二维电泳后，SDS-PAGE凝胶用固定液（10%冰醋酸、40%甲醇、50%超纯水）固定3小时，凝胶固定后用超纯水洗涤3次。每次15秒，分钟；加入考马斯亮蓝染色液（0.12%G-250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%甲醇）摇匀过夜；超纯水至背景满意，脱色。
5. 质谱鉴定和数据库分析
图像扫描仪扫描脱色凝胶，使用Biorad PDQuest 8.0软件分析不同玉米叶材料的凝胶图谱，按照YANG等人的方法计算蛋白质的相对表达水平（Vol），并表达每个匹配蛋白点的表达量。 ） 财富。对于不同蛋白质的表达水平分析，使用Z58和ZD958材料的凝胶作为参考凝胶，并且只有在至少两次重复中发现的蛋白质点才被认为是真正的蛋白质点。平均相对表达量上调（出现）或下调（消失）超过2倍（比率> 2），统计T检验显示P
扫描电泳凝胶图谱后，使用Biorad PDQuest8.0软件识别每种转基因材料及其对照（1#和6#、4#和6#、2#和5#、3#和5#）。我们使用质谱仪分析了凝胶上相对表达水平超过两倍的斑点，并成功鉴定了61 种玉米基因组蛋白（表1）。进一步分析特定蛋白点（转基因和对照之间仅在一种材料中出现）和不同蛋白点，发现这些蛋白点中，有15个二磷酸核酮糖羧化酶相关蛋白点；发现有4个ATP合成酶型蛋白点。 4个蛋白质点。 13个增氧蛋白点，3个丙酮酸磷酸双激酶相关蛋白点，2个GADPH酶相关蛋白点，4个gelmin样蛋白相关蛋白点，2个草铵膦乙酰转移酶相关蛋白点（3#和4#） 、 6 个其他蛋白点和10 个功能未知的蛋白点。这些蛋白质涉及的生化反应过程主要集中在光合作用、固碳和能量代谢等方面。根据不同蛋白的功能和质谱检测结果，对不同转基因材料中不同蛋白的变化趋势进行汇总分析（表2）。结果表明，被认为参与植物应对逆境胁迫的类胚芽蛋白的表达在4种转基因玉米材料中显着增加，并且在4#材料中仅检测到质体蓝素钠蛋白。已显示。表达显着降低，参与光合作用和固碳的相关酶，如二磷酸核酮糖羧化酶、ATP合酶、丙酮酸磷酸二激酶等表达显着上调。 1#和4#材料中，均在ZD958背景下，胚芽样蛋白、二磷酸核酮糖羧化酶和PS II促氧蛋白的表达量均显着升高，而同一材料中2#、3#材料中Z58背景显着增加了包括ATP合酶、氧促进蛋白、胚芽样蛋白、肽基脯氨酰顺反异构酶等蛋白的表达。具有相同遗传背景的转基因玉米材料（1#和4#、2#和3#）在引入不同的抗虫Bt基因后引起的蛋白质水平的变化有一定的一致性，我理解这一点。然而，将不同遗传背景（3#和4#）的转基因材料导入同一个抗虫Bt基因后，在蛋白质水平上的表达变化却有较大差异。
此外，当我们将四种转基因材料获得的特定蛋白点与导入转基因材料中的Bt蛋白序列进行比较时，我们发现特定蛋白点#3802、#4719、#3707和#3708被鉴定为Bt蛋白。发现它对应的是分别为cry1Ab、cry1Ie、mcry1Ac 和mcry1Ac。这意味着导入转基因材料的Bt基因可以在玉米中成功表达，并且可以通过二维电泳分离鉴定这些Bt蛋白，最终通过蛋白质组学分析获得特异的蛋白点，这表明它体现在
2. 不同蛋白的GO分析和KEGG分析
虽然实验中得到的不同蛋白点初步通过BLASTx进行了鉴定并获得了蛋白信息，但这些蛋白在细胞组成、生物途径、分子功能上是否具有共性还有待观察，是否具有特异性代谢是否具有共性还有待观察。途径更加丰富。推断。 GO 和KEGG 分析分别用于富集这些不同蛋白质的生物学功能和代谢途径。结果，虽然转基因材料和对照材料之间存在差异，但它们主要集中在与光合作用相关的蛋白质上，在专门的蛋白质或特定的代谢途径上没有观察到明显的变化。比较SK12-5zd和ZD958，总共有5个与不同生物途径相关的蛋白有差异表达，其中包括3个与光合作用相关的蛋白和3个与还原性戊糖磷酸循环相关的蛋白。我发现：蛋白质，四种与不同细胞成分相关的蛋白质（特别是膜的两种外部成分和光合作用系统II 释氧复合物）和两种相关蛋白质。
比较Bt799zd和ZD958，7个与不同生物途径相关的蛋白有差异表达，包括4个光合作用相关蛋白、2个光呼吸相关蛋白和2个碳固定相关蛋白，发现有4个不同分子量的蛋白表达。功能存在差异表达，即两种核酮糖二磷酸羧化酶活性蛋白（核酮糖二磷酸羧化酶活性）和两种单加氧酶活性蛋白（单加氧酶活性），细胞组成分析显示膜上还发现四种蛋白存在差异表达，其中两种蛋白质的外部成分。两种光合系统II 析氧复合物相关蛋白。
对比IE034z和Z58，与不同生物途径相关的4个蛋白存在差异表达，均为光合途径相关蛋白；与细胞组成和光合系统相关的3个膜外蛋白发现5个蛋白存在差异表达，其中包括II释放。有两种氧复合物相关蛋白，分子功能分析显示三种钙离子结合蛋白存在差异表达。比较Bt799z和Z58，有4个生物途径相关蛋白差异表达，均为光合途径相关蛋白，且根据细胞组成分析，差异表达有3个膜外蛋白和光合途径相关蛋白，包括II释放在内的6个蛋白发现差异表达；三种氧复合物相关蛋白；三种分子功能为钙离子结合的蛋白也发现差异表达。
通过KEGG分析，通过控制表达水平上调或下调2倍来筛选转基因和非转基因对照材料之间的不同蛋白质，并在SK12-5zd和ZD958的比较中，检测到不同的蛋白质。当比较Bt799zd和ZD958时，差异蛋白在光合生物碳固定途径、光合作用和碳代谢等几个代谢途径中显着富集。 IE034z和Z58以及Bt799z和Z58之间的比较显着富集了光合代谢途径中的不同蛋白质。
三、讨论
转基因植物的开发与推广，转基因生物及其产物的分析与鉴定，转基因的直接表达产物和间接调控产物对转基因生物生长发育、生态环境、食物链、人类的影响食品安全如何日益受到影响。由于现有转基因生物中外源基因的表达和调控产物很多是蛋白质，因此在蛋白质水平上对转基因生物进行评价显得尤为重要。随着蛋白质组学的兴起和发展，目前正在全球范围内进行评价等级。提供了蛋白质水平的可能性。
在本研究中，对四种转基因抗虫玉米材料及其非转基因对照玉米材料进行了蛋白质组分析。将每种材料在二维电泳凝胶上分离后，可检测到1200个蛋白点，并使用PDQuest8.0软件分析蛋白质组表达谱，以确定转基因材料与对照的表达差异，检测到四种不同的Bt杀虫剂。我们还鉴定了61 个表达水平发生显着变化的蛋白点，主要集中在光合作用、同化物积累和能量代谢过程。光合生物固碳途径中的不同蛋白质参与各种基因修饰，如——核酮糖1,5二磷酸羧化酶，它是决定光合作用碳同化速率的关键酶，以及光合途径中的C4二氧化碳固定作用。在材料中检测到。四种转基因材料中的关键酶——丙酮酸磷酸二激酶、促氧蛋白、植物应激反应性芽素样蛋白和ATP合酶均显着上调。背景也可能与转基因玉米的抗虫性有关，GO和KEGG分析的结果也证实了上述差异的存在。理论上，增强光合作用会增强生物体的抗逆能力，使植物生长更旺盛，提高植物的光合能力，这需要进一步观察和分析。光合作用和固碳过程增强，涉及大量能量物质的流动，而这些能量物质的去向与外源Bt蛋白的表达之间是否存在相关性，目前尚未详细分析。
在这项研究中，我们发现所有转基因材料中的germin-like蛋白均显着上调，该蛋白是一种位于细胞外基质中的可溶性糖蛋白，在植物中普遍存在，大部分是稳定的寡聚体，其功能是：响应有害的压力；这类蛋白的表达上调表明，抗虫转基因玉米材料要达到抗虫的目的，依赖于对靶标生物有毒害的蛋白的表达，这可能表明了一个共同的机制：变化可能存在。由于它会影响其他应激反应，因此需要通过后续逆境应激反应的评估和分析来详细研究其具体作用机制。
转基因作物蛋白质组的差异一方面是由外源基因的插入引起的，另一方面也是由环境因素引起的。本研究所有材料均在温室中培养至5叶1心阶段，很大程度上避免了环境因素的影响，结果体现的差异主要是由于外源物的插入导致蛋白质组的变化基因。人们认为存在差异。据此发现受体材料的遗传背景可以影响转基因材料蛋白质表达的差异。本研究中使用的转基因自交材料都是经过高世代选育获得的稳定材料，其基因组差异很小，因此与回交亲本材料有所不同，比较中发现的蛋白质差异可能主要是外源性的。基因插入和表达引起的变化。我们的结果还表明，具有相同遗传背景的转基因材料之间的蛋白质表达变化相对一致，而在通过杂交制备的转基因杂交材料中；杂交过程的不确定性导致检测到外源基因表达和更多差异表达的蛋白质。杂交过程影响蛋白质组，我们再次证实了具有相同背景但转染相同基因（3）#和4#）的材料之间蛋白质水平的差异，表达量显着不同。这与抗虫玉米Mon810相关蛋白质组的对比分析结果基本一致。也就是说，转基因玉米个体的蛋白表达谱不存在显着的个体差异，主要差异是由于遗传背景的差异造成的。基因组的。
抗虫转基因玉米的生物安全评价过程非常重视其食品和饲�**踩Ｗ酆戏治霰狙芯拷峁砻鳎闹只蚬こ逃衩撞牧现芯醇觳獾接跋焐攀郴蛩茄踩男碌鞍字剩抑参锷怼⑸⒋换蚬δ芊矫婢醇觳獾骄哂兄匾δ艿牡鞍字省＜觳獾街参锷蚍⒂７⑾止舻鞍缀投舅氐鞍子忻飨缘谋泶锉浠Ｓ捎诘鞍字适蔷哂猩锕δ艿奶鼗蠓肿樱蛑参锸称钒踩缘谋浠苯臃从吃诘鞍字仕缴稀Ｕ庀钛芯勘砻鳎购Τ孀蛴衩自诘鞍字仕缴喜换岵杉觳獾降挠跋炱浒踩缘牡鞍字食煞帧Ｗ虿牧现械鞍字实母谋渲饕性诠夂献饔谩⑼锘酆湍芰看还讨校庑┕逃胱虿牧系陌踩怨叵挡淮螅膊⒎鞘怯跋彀踩缘奈抟馐缎вΑ�
4。结论
SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd 4种转基因抗虫玉米材料与对照蛋白质组相似度较高，但缺乏光合作用、固碳、ATP合成途径等基础代谢过程。与之相关的基因很少。 - 观察到调节表达，但未发现该基因的异常表达。测试的四种转基因材料在蛋白质水平上没有显示出可能影响安全性的意外影响。
作者：郝文元、李飞舞、严伟、李丛丛、郝东云、郭长虹
作者单位：哈尔滨师范大学生命科学与技术学院、吉林省农业科学院