生物膜蛋白具有什么功能，膜蛋白生物学功能

文| 乐友爱笑不爱哭

编辑| 乐友喜欢笑，但不喜欢哭。

简介肠杆菌科是肠杆菌科中最大的科，包括模式动物病原体大肠杆菌以及被描述为植物相关细菌的属，例如肠杆菌科、植物杆菌属和Cosonia。这些属的一些菌株不仅对人类致病，而且对植物也致病，揭示了该科内致病性和互利共生之间的细微界限。

尽管肠杆菌科内部存在分类学和表型多样性，但有关该科内群体感应系统的大多数知识都源自大肠杆菌模型。群体感应是细菌细胞根据群体增长调节基因表达的能力。这种机制影响细菌。涉及控制菌落行为以及细菌与其植物宿主细胞之间相互作用的结果的特征。

有趣的是，编码双组分系统的QseEF 和QseG 基因是共转录的。 QseG 是一种与-螺旋蛋白同源的外膜蛋白。在本研究中，QseG 对于大肠杆菌K-12 中的QseEF 活性很重要。

关键基因在大肠杆菌K-12 qseG 突变体中，QseE 无法磷酸化和激活反应调节蛋白QseF，并且与共转录蛋白QseE 和QseF 一样，QseG 也在肠道致病菌的毒力中发挥作用。控制中的作用该基因的突变对鱼类病原体迟缓爱德华氏菌在小鼠巨噬细胞中的存活及其在斑马鱼中的毒力产生深远影响。

肠出血性大肠杆菌qseG突变株比野生型菌株定植兔肠道细胞的能力较低，这表明QseG对于多种肠道病原体的发病机制很重要，但其作用机制因细菌种类而异。不同的。相比之下，研究表明QseG在EHEC中发挥调节III型分泌系统功能的作用。

QseG 与鼠伤寒沙门氏菌血清型中的鞭毛相变密切相关，并相应地控制鞭毛识别。与野生型菌株相比，QseG 缺失菌株的毒力较低，并且在幼年兔模型中肠道定植减少。

qseEGF 共转录本的功能已在肠道病原菌和多个属的非病原菌株中得到表征，这些菌属具有潜在的qseEGF 共转录本，但在包括植物相关肠杆菌科在内的非病原细菌中。在病原菌株中，QseG 的特定作用未知。

植物相关肠杆菌科细菌中QseG 蛋白的表征将有助于探索植物-细菌相互作用的分子基础，并更好地了解它们在肠杆菌科细菌中的功能。该家族与其宿主之间的相互作用范围从致病到互惠，我们研究了QseG 在Kosakonia sp. MH5 共生梭菌中索根瘤菌LMS-1 和鹰嘴豆之间的作用。 MH5 菌株是一种从鹰嘴豆根中分离出来的内寄生细菌，具有多种促进植物体外生长的机制。

在体内实验中，与LMS-1共接种的结果表明，菌株MH5的QseG可以促进鹰嘴豆在高盐条件下的生长。这表明菌株MH5 中的QseG 通过主动干扰宿主植物根部定殖和感染过程来维持其功能，其方式类似于动物中肠杆菌科病原体的作用。在根部和根瘤内，QseG 可以适当地侵入和建立，从而有益地影响盐分条件下鹰嘴豆与梭状芽胞杆菌的共生关系。这一发现表明QseG在控制盐胁迫下植物-细菌共生方面发挥着重要作用。

细菌菌株和生长条件鹰嘴豆根瘤菌菌株Mesorhizobium ciceri LMS-1，在蛋白胨酵母培养基中，需要在28C 下常规培养，大肠杆菌菌株，在Luria-Bertani 培养基中，需要在37C 温度下生长，转游戏为了培养蜱细菌菌株大肠杆菌WM3064，将间二氨基己酸添加到培养基中至终浓度为300 M。

生物传感菌株根癌农杆菌NTL4 和染色质弧菌CV026 分别在AT 基本培养基和LB 培养基中于28C 培养，并补充100 g/mL 氨苄青霉素、50 g/mL 凝乳霉素、30 g/mL 庆大霉素和10 g根据需要，向培养基中添加/mL 四环素或25 g/mL 氯霉素。

qseG 突变体的表征为了确定MH5 WT 及其衍生物产生的脂肪酰同源丝氨酸内酯的程度，我们使用了两种能够检测长链或短链AHL 的生物传感器菌株。转化的生物传感器菌株A. tumefaciens NTL4用于检测长侧链AHL，C. violaceum菌株CV026用于检测短链AHL。为每种菌株、MH5 WT 及其衍生物准备适当的培养基，并在28C 下孵育过夜。

测定短链AHL 时，取50 L 含有内生细菌的细胞悬液，其中添加了5-溴-4-氯-3-吲哚基--D-吡喃半乳糖苷，悬浮细胞，均匀涂抹在悬液上。 LB 琼脂平板。培养板干燥后，接种4 滴3 L 过夜培养的NTL4。 28C 孵育48 小时。

测定长链AHL时，将各细菌内生菌株和生物传感器菌株CV026以约1cm的间隔在LB琼脂培养基上划线，并在28培养96小时。通过上述步骤，该生物传感菌株可用于检测MH5 WT及其衍生物产生的一系列脂肪酰同源丝氨酸内酯，以及分别长链和短链AHL的活性。

为了获得qseG 突变菌株的运动数据并与WT 菌株进行比较，我们使用含有0.5%（w/v）琼脂的TSB 琼脂平板评估了每个菌株的集群运动。菌株在TSB 培养物中培养过夜。将培养悬浮液调节至OD590nm浓度为2并滴到培养板的中心。

将培养板在28下培养14天，通过从接种点起的径向扩张速率来确定运动性的差异。根据微孔PVC板生物膜形成实验的方法，每个处理进行五次重复实验。有一些改变。

TSB培养基28培养过夜后，调节培养基OD600nm至0.1，将100l细胞悬液转移至96孔PVC板的每孔中，密封板，28培养8小时。 C.马苏。置于C 下，不搅拌，并使用BioRad 酶标仪在565 nm 处测量细胞增殖。除去培养基后，将附着在表面的细菌生物量用125L 0.1%结晶紫水溶液染色，孵育10-15分钟，然后用蒸馏水简单洗涤孔，干燥，并用80%洗涤液洗涤。乙醇：20% 使用。通过将剩余染料溶解在丙酮溶液中并测量其在565 nm 处的吸光度来定量。

通过细胞生长培养对生物膜形成进行标准化对于每次处理，测量96 孔PVC 板的8 个孔在28C OD590nm 的TSB 培养基中过夜孵育后，还评估了沙子上生物膜的形成情况，至0.4 添加500 L 细菌溶液或将等体积的TSB培养基加入到装有600 mg无菌沙的1.25 mL试管中制备并接种。在28C 下以200 rpm 搅拌孵育72 小时后，除去介质，用1x 磷酸盐缓冲液洗沙一次，在1x PBS 中重悬1 mL 细胞，然后转移CyFlow Cube8。使用细胞。

为了评估qseG突变菌株对盐度和锰的耐受性并能够将其与野生型菌株进行比较，对于所有处理，通过在过夜孵育后在液体培养基中生长期间测量细菌的OD565nm来测试细菌是否增殖。 TSB中的细菌培养为0.1。生长后，将MH5野生株和突变株培养在添加1氯化钠或1mM锰的M9培养基中作为胁迫条件，并在普通M9培养基中作为对照条件培养，每个处理重复3次。

共生效应在评估qseG突变体对豆科植物-根瘤菌共生的影响时，我们使用共生鹰嘴豆-根瘤菌模型在足够盐度条件下的实验生长室中进行了植物生长实验。 M. siceri LMS-1 是一种特征良好的根瘤菌共生微生物，如前所述，用于对鹰嘴豆种子表面进行灭菌和预发芽。使用含有各发芽幼苗的细菌悬浮液来接种各发芽幼苗。细菌为1。

为了诱导盐胁迫，每周用无氮营养液浇水3次，在植物生长的第二周，在无氮营养液中添加0.075%的水，直至实验结束。氯化物。同时制备四种处理组合，其中鹰嘴豆单独接种LMS-1，同时接种LMS-1和MH5野生型菌株，同时接种LMS-1和qseG突变株，同时接种LMS-1 。和qseG-KI菌株。

每个处理使用五个盆栽原型单元，6周后收获植物并记录根瘤数、根瘤干重、根干重和地上干重。记录了6 周龄植物的鹰嘴豆根茎中的根瘤形成情况。如前所述，切除簇并进行显微镜检查。从每个处理的至少三个代表性植株中提取结瘤组，制作显微切片，并在Leica DM6000B显微镜下的明视场显微镜下检查甲苯胺蓝染色的结瘤横截面。

基因表达分析揭示了MH5 野生型菌株和qseG 突变体在28C 在TSB 培养基和鹰嘴豆根分泌物的混合物中培养24 小时后与豆类宿主相互作用的早期阶段特定基因的表达。评估了水平。为了确保完全破坏细菌细胞壁，对细胞进行机械裂解，并使用Absolutely RNA Miniprep 试剂盒提取总细菌RNA。每个菌株使用三个生物学重复。为了评估鹰嘴豆对接种MH5 野生型或qseG 突变菌株的反应变化，我们进行了植物生长实验，其中鹰嘴豆幼苗与LMS-1、MH5 野生型菌株或LMS-1 共同接种。将同时接种突变体和单独接种LMS-1 的鹰嘴豆幼苗用作对照。

接种细菌24小时后，用蒸馏水轻轻彻底清洗整个根系，将根与茎分离，冷冻在液氮中并使用研钵和研杵研磨成细粉，并且- 储存在80 。在C 下进行处理以进行进一步分析。每个重复汇集三棵幼苗，每个处理使用三个生物重复。使用Maxwell 16 LEV SimplyRNA Tissue Kit 从鹰嘴豆幼苗中提取总RNA，并使用NanoDrop 800 紫外-可见分光光度计进行分析。使用1% 琼脂糖凝胶电泳检查从植物中提取的RNA、浓度和纯度以及RNA 完整性。

为了评估与植物-微生物相互作用相关的基因表达水平的变化，使用NZY 第一链cDNA 合成试剂盒通过逆转录纯化约2 g 总细菌RNA 和1 g 鹰嘴豆幼苗，并将其合成为cDNA。一方面分别分析MH5 WT 和qseG 突变系中暴露于鹰嘴豆根分泌物后的ompA、tagJ 和virK 基因，一方面评估接种LMS-1 的鹰嘴豆幼苗中植物防御反应相关基因的表达谱，即、CaBOOH 样、CaPR1 和CaFLS2。

分别接种MH5 WT或qseG突变株。使用Primer-Blast NCBI 工具设计这些靶基因的引物。 16S rRNA基因用于标准化细菌靶基因的表达，并使用Ca18SrRNA和CaGAPDH基因。标准化细菌中目标基因的表达标准化鹰嘴豆中目标基因的表达。在cDNA 样品上测试引物对，以确保目标区域的扩增。通过在6095C 下进行的熔解曲线分析来验证扩增反应的特异性。使用7500 在96 孔板中进行实时定量PCR。实时PCR检测系统和Green Master MixROX试剂盒。

使用的cDNA 用Dnase/RNase 酸酐稀释5 倍，20 L 反应体积中使用800 ng。根据制造商的说明进行实验。对于每个基因，我们在三个生物复制中进行了三个技术复制。还运行无模板对照来检测DNA 污染或引物二聚体。根据2-Ct方法测定靶标的表达水平。这里，Ct是目的基因的Ct值与参考基因的Ct值之间的差值，根据Willems等人的方法计算并归一化。

能力评估为了使用标准稀释板方法评估MH5 WT菌株和qseG突变体在根部定殖的能力，将鹰嘴豆幼苗在用LMS-1和MH5 WT或qseG突变体生长的植物中生长，并进行生长测定。共接种，并在幼苗接种细菌后24、48和72小时进行根部取样。用无菌水彻底清洗根部后，将其横向切成两个大小相等的部分，留下靠近种子的部分，每个处理从三株植物中收获根系统。切片到3x Ringer 溶液中。

以最大速度涡旋2 分钟，通过离心收集细菌细胞，并悬浮在3x 林格氏溶液中。要获得根内细菌，请按照Rashid 等人的描述切割根并对表面进行消毒。用3x Ringer 溶液研磨杵。制备细菌悬浮液的系列稀释液，将每种稀释液的100 L 接种到含有20 g/mL 氨苄青霉素的TSA 培养基板上，并将培养皿在28C 下孵育48 小时。在每个重复中使用三种植物进行三个生物重复。

为了可视化鹰嘴豆根部定植，将表面灭菌和预发芽的鹰嘴豆种子接种红色荧光蛋白标记的MH5 WT 和绿色荧光蛋白标记的qseG 突变体。 0.75%水琼脂平板。如上所述，用400 L OD600 为0.4 的细菌悬浮液接种每株植物。用双层滤纸覆盖植物并在生长室中孵育5 天。切掉植物的根，小心地将它们从培养皿中取出。使用共焦激光扫描显微镜在载玻片上观察根系统，并且对于每个处理和未接种的对照观察至少两个含有三株幼苗的培养皿。

结论该菌株能够逃避植物的免疫系统，高效定植鹰嘴豆根细胞，并侵入根系和根瘤建立适当的关系，对困在盐碱环境中的鹰嘴豆和假单胞菌非常有效，可以攻克断腿。细菌共生的有益作用极其重要。植物相关内寄生肠杆菌科中的QseG 通过主动干扰宿主定植和感染过程来维持其功能，类似于在动物肠杆菌科病原体中观察到的情况。

这表明其作用与肠杆菌科细菌相似，并且在与宿主的相互作用中广泛存在。这一发现揭示了有益豆科植物内生菌肠杆菌科之间相互作用的分子基础，并研究了它们的有益和致病特性。肠杆菌科之间的细线是

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