大肠杆菌的分离纯化步骤，为什么不用大肠杆菌提取dna
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|革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）具有三层细胞膜：外膜(OM)、肽聚糖细胞壁和内膜(IM)。内膜是由磷脂分子组成的双层膜，上面布满了各种功能的蛋白质；外膜主要由脂多糖（LPS）、磷脂和蛋白质组成，其上有大量的孔蛋白。存在。虽然内膜在主动运输中发挥重要作用，但外膜具有重要的免疫学和致病意义，并且还可以防止蛋白质从周质空间渗漏。分离内膜和外膜不仅有助于研究细胞膜的组成、结构和功能，破译细胞内蛋白质和脂质的位置和功能，而且还可以使用苯乙烯-马来酸分离膜。也是蛋白质纯化的第一步。它还可以帮助您更深入地了解细胞膜的工作原理。蔗糖梯度超速离心是分离革兰氏阴性菌内膜和外膜最常用的方法。这些方法用溶菌酶/EDTA（乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸）处理细菌细胞。 EDTA 螯合二价阳离子并破坏相邻LPS 分子之间的相互作用。然而，EDTA 的阳离子螯合可能会影响一些膜蛋白的功能和结构，这些膜蛋白需要二价阳离子（例如Ca2+、Mg2+、Zn2+）来稳定其三级结构并保持活性。在本协议中，我们以大肠杆菌内膜和外膜的分离为例，介绍一种相对简单的蔗糖梯度超速离心方法。该方法不使用溶菌酶或EDTA进行处理，有利于后续膜蛋白的纯化。相关研究发表在《Bio-protocol》上，标题为“Separation of inner and external membrane of Escherichia coli by EDTA-free sucrose梯度离心”。
1. 材料和试剂1. 125 mL 烧瓶(PYREX, 4980) 2. 2800 mL 烧瓶(PYREX, 4420) 3. 移液器吸头4. 血清移液器5. 1 L 离心瓶(Thermo Scientific, NalgeneTM, 3141-1006) 6 70 mL 超速离心瓶(Beckman Coulter, 355622) 7. 37 mL 超速离心管(Beckman Coulter, 344058) 8. 组织研磨机(DWK Life Sciences, 8853030040) 9. LB 培养基粉末(Research Products International, L24400-5000.0) 10. TB中等粉末(Research Products International, T15100-5000.0) 11. 琼脂(BD, BactoTM, 214010) 12. Tris (American Bio, AB02000-05000) 13. 氯化钠(NaCl) (Dot Scientific, DSS23020-5000) 14. 甘油(J.T. Baker, 2136-03) 15. 硫酸卡那霉素(American Bio, AB01100-00010) 16. 大观霉素(Research Products International, S23000-25.0) 17. 氯霉素(Sigma, C0378-25G) 18. 蔗糖(Sigma-Aldrich) ，S0389-1 KG) 19. IPTG（异丙基-d-1-硫代半乳糖苷）（American Bio，AB00841-00010） 20. PMSF（苯氟（甲基磺酰基））（Dot Scientific，DSP20270-25） 21. 2-巯基乙醇（ Sigma-Aldrich, M6250-100ML)22. 表达YejM/LapB 复合物的大肠杆菌BL21 (DE3) star plysS 菌株的甘油储备液[10] 23. 盐酸(J.T. Baker, 9535-00) 24. LB 培养基（参见25. LB 琼脂平板（参见配方） 26. TB 培养基（参见配方） 27. 1 M Tris-HCl，pH 7.8（ 28. 裂解缓冲液（参见配方） 29. 稀释缓冲液（参见配方） 30. 73%蔗糖（参见配方） 31.53% 蔗糖（参见配方）
32. 20%蔗糖（见配方）
2. 设备和软件1. 移液器（P200、P1000） 2. 移液器（BrandTech Scientific、accu-jet pro） 3. -80C 超低温冰箱（PHCbi、MDF-U76VA-PA） 4. 微生物培养箱(VWR, F Air 6.3 CF) 5. 培养箱摇床(New Brunswick, InnovaTM 44) 6. 离心机(Thermo Scientific Sorvall, BP8) 7. 超速离心机(Beckman, OptimaTM LE-80K) 8. 高压微流化床(Avestin, Emulsi Flex) -C3) 9. 固定角转子（Beckman Coulter，45Ti 型） 10. 水平斗式转子（Beckman Coulter，SW 28）
11. 超纯水系统（Millipore，参考A+）
3. 实验过程A. 全细胞膜制备1. 使用表达YejM/LapB 复合物的大肠杆菌BL21 (DE3) star plysS 菌株的甘油原液，含有50 g/mL 硫酸卡那霉素和50 g/mL 壮观霉素。 g/mL 氯霉素（Kan+、Spe+、Cam+）在LB 板上划线。将板置于37C 微生物培养箱中培养过夜。 2. 将过夜培养板中的单个菌落接种到含有20 mL LB 培养基（Kan+、Spe+、Cam+）的125 mL 烧瓶中。将细胞在37C 下培养过夜，并以220 rpm 摇动。 3. 将10 mL 过夜培养物转移至含有1 L TB 培养基（Kan+、Spe+、Cam+，总共2 L）的2800 mL 烧瓶中。 37C 孵育，220 rpm 振荡，直至OD600 为0.6.4。将200 L 1 M IPTG 添加到1 L 细胞培养基中，终浓度为0.2 mM，30C 振荡。孵育细胞，同时220 rpm 下4 小时。 5. 将培养物在4C 下以5,000 g 离心10 分钟，收获细胞。 6. 将细胞沉淀重悬于含有1 mM PMSF 和5 mM 2-巯基乙醇的40 mL 裂解缓冲液（参见配方）中。在此步骤中，您可以将重悬的细胞快速冷冻在液氮中并将其储存在-80C的超冷冰箱中，或者直接进行步骤A7以破碎细胞。 7. 将细胞转移至40 mL 组织研磨机中，并通过推拉研磨杵10-20 次来匀浆细胞。 8. 在高压微流化器中以15,000 psi 的压力两次破碎细胞。 9. 将破碎的细胞转移至50 mL 离心管中，并在4C 下以5000 x g 离心10 分钟。 10. 将上清液转移至70 mL 超速离心瓶中，加入裂解缓冲液至50 mL。小心平衡超速离心瓶。 11. 使用Beckman Coulter 45Ti 转子在4C 下以40,000 rpm (185,677 x g) 超速离心2 小时。离心后保留膜沉淀。 B. 内膜和外膜的分离1. 使用40 mL 组织研磨机，将约3 g 膜沉淀重悬于55 mL 20% 蔗糖中。 2. 准备六个37 mL 超速离心管。每管从下到上依次含有14 mL 73% 蔗糖、14 mL 53% 蔗糖和9 mL 20% 蔗糖膜重悬液。 3. 使用SW 28 转子在4C 下以23,000 rpm (65,000 g) 离心18 小时。 4. 离心后，得到两条条带。上带是内膜，下带是外膜（图1）。
图1. IM 和OM 的分离
5. 将P1000 移液器吸头末端修剪约5 毫米，并使用剪断移液器收集上层衬管。 6. 使用新的移液器吸头，重复步骤B5 以收集外膜层。 7. 将外膜和内膜转移至70 mL 超速离心瓶中。向瓶中添加稀释剂，使最终蔗糖浓度低于10%。小心平衡超速离心瓶。 8. 使用Beckman Coulter 45Ti 型转子在4C 下以40,000 rpm (185,677 g) 超速离心2 小时。 9. 弃去上清液并称量湿膜的重量。每克膜添加10 mL 裂解缓冲液，并在40 mL 组织研磨机中重悬。 10. 将薄膜在液氮中快速冷冻，并保存在-80的超低温冰箱中。注：1.本方法以表达YejM/LapB复合物的大肠杆菌BL21(DE3)star plysS菌株为例，进行内外膜分离。该方法也可应用于其他大肠杆菌菌株。 2. 本实验方案中使用的所有缓冲液必须保持在4C。 3. 分离内外膜时，每个37 mL 超速离心管中的膜总量不要超过0.5 g。否则，内膜和外膜可能无法正确分离。
4. 通过超速离心去除膜上的蔗糖，最终蔗糖浓度必须低于10%。
4. 配方1. LB 培养基将25 g LB 培养基粉末溶解在1 L 去离子水中。 121C 高压灭菌30 分钟。 2. LB 琼脂平板含有含1.5% 琼脂(w/v) 的LB 培养基。 3. TB 培养基将47.6 g TB 培养基粉末与4 mL 甘油混合，并溶解在1 L 去离子水中。 121C 高压灭菌30 分钟。 4. 1 M Tris-HCl，pH 7.8 将121.14 g Tris 溶解在800 mL Milli-Q 水中，用盐酸调节至pH 7.8，并用Milli-Q 水补足至1 L。 5. 裂解缓冲液50mM Tris-HCl，pH 7.8300mM NaCl10% 甘油(v/v) 6. 稀释缓冲液50mM Tris-HCl，pH 7.8300mM NaCl7. 73% 蔗糖73% 蔗糖(w/v) 20 20 mM Tris- HCl，pH 7.88，53% 蔗糖53% 蔗糖(w/v) 20 mM Tris-HCl，pH 7.89，20% 蔗糖20% 蔗糖(w/v)
20mM Tris-HCl，pH 7.8
5. 原始信息Shu, S. 和Mi, W. (2023). 通过无EDTA 蔗糖梯度离心分离大肠杆菌内膜和外膜. Bio-protocol 13(6): e4638. DOI: 10.21769/BioProtoc .4638 .（原文链接：https://s.bio-protocol.org/5287abeff4d4bc54）
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Bioprotocol概述Bioprotocol于2011年成立于斯坦福大学，致力于打造全球权威、高质量的生物实验方案共享平台，加速科学发现。 Bio-protocol Journal是一本基于生物协议的同行评审国际学术期刊，旨在发表高质量的生命科学实验方案，提高科学研究的可重复性。迄今为止，Bio-protocol已发表了全球数万名顶尖科研人员（包括多位诺贝尔奖获得者）的5000多个实验方案，是Science和eLife之间的合作，促进生命科学研究的可重复性。 2019年Bio-protocol杂志发表在PubMed Central和ESCI上。