国内首款car-t细胞疗法，car-t细胞疗法新闻
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赵林， 赵新汉. CAR-T细胞技术的研发及临床应用前景[J]. 我国合理用药探索， 2020, 17(2): 1-7.
[摘要] 近年来，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR T）在血液恶性肿瘤的治疗中表现出强大的疗效，为晚期和罕见恶性肿瘤的治疗带来了巨大的益处。治愈癌症的最终目标终于可以实现。从结构和功能出发，帮助您更清楚地了解CAR-T细胞技术的应用和研发，以及目前CAR-T技术研发和应用的瓶颈。通过靶分子的适当选择和优化、安全有效的载体设计、免疫杀伤细胞的合理改造、治疗过程中副作用的预防和治疗以及诸多基因编辑技术的引入，CAR-T疗法将得到更广泛的应用在临床实践中。 CAR-T细胞技术的研发范围还是很广的，包括抗病毒和癌症干细胞的研发，前景非常广阔。
[关键词] 嵌合抗原受体， 嵌合抗原受体T细胞免疫治疗， 结构与功能， 肿瘤
CAR-T疗法的正式名称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。这一概念最早由Gross等人于1989年提出，近年来进展非常迅速，不断完善和发展。 CAR-T细胞技术是一种过继性T细胞疗法，其特点是在T细胞表面产生嵌合抗原受体，诱导T细胞靶向并杀伤肿瘤细胞。与传统的过继细胞疗法相比，CAR-T细胞技术可以避免抗原呈递，进入人体后可以长时间存活并继续复制。 CAR-T细胞疗法表现出较强的技术特性和良好的重现性，在血液恶性肿瘤的治疗中表现出优异的临床疗效，在肿瘤治疗方面优于其他现有的免疫细胞疗法，正在受到越来越多的关注。更多的研发机构和临床中心正在对其进行投资并进行大量的临床试验。本文重点关注结构和功能，部分详细介绍了CAR-T细胞技术的发展和应用，并对快速发展的CAR-T技术进行展望。
1. CAR-T的总体结构和功能
经典的嵌合抗原受体（CAR）由五部分组成：识别肿瘤抗原的抗体单链可变区、铰链区、跨膜区、共刺激区和T细胞激活区，你可以将它们分开。 CAR-T细胞技术利用外源基因转染技术，将患者的T细胞或工程化T细胞转化为可识别肿瘤相关抗原（TAAs）和T细胞激活序列（通常是CD3ze或T）的单链可变片段（scFv）。细胞激活序列）。 FcRI) 在T 细胞表面表达。 scFv 通过跨膜区域与T 细胞的细胞内激活和增殖信号传导域结合。然后这些工程化T细胞在体外进行纯化，大量扩增，并重新注射到患者体内，最终在非主要组织相容性复合体（MHC）限制模式下产生有效的抗炎活性，这显示了效果。由于CAR-T细胞的作用过程不受MHC限制，因此CAR-T细胞技术在一定程度上具有多靶点性，可以识别并杀伤表达相同抗原的肿瘤。到目前为止，CAR-T细胞技术主要经历了四代的研发，但也有一些研究认为V代应该是通用的嵌合抗原受体。详细信息请参见表1。
现有研究表明，T细胞的充分激活依赖于双重信号和细胞因子的作用。例如，即使仅包含CD3ze 序列的CAR 也必须由共刺激信号激活。这可能是CAR-T 的第一步。第一代FR CAR-T细胞在I期临床试验中对晚期卵巢癌的抗肿瘤功效无效的主要原因[2]。为了实现这一目标，第二代和第三代CAR在嵌合受体上添加CD28、CD134、CD137等共刺激分子（CM），从而激活T细胞并增加杀伤毒性和增殖。并且T细胞的存活时间延长了。对于哪些共刺激分子（例如CD28、CD134 和CD137）作为CAR 的作用优劣的研究存在分歧[3-4]。有研究认为CD28刺激维持CD4 T细胞处于中枢记忆细胞状态，CD137促进CD8 T中枢记忆细胞增殖[5-6]。第四代CAR-T细胞技术包括自杀基因的添加、免疫因子的整合表达、整合共刺激因子配体等精准控制方法，并且包括可能还包括刺激因子的添加。总体而言，目前第四代CAR-T细胞技术的研究更多集中在基因改造和免疫微环境改造上，并且在基因改造方面已经取得了长足的进展（例如自杀人工控制开关的研究）[7]。引入磷酸肌醇3-激酶（PI3,K）抑制剂、MegaTAL基因编辑技术敲除TCR、PD-1敲除、引入CRISPR-Cas技术。免疫微环境的修饰是第四代CAR调节性T细胞的主要研究目标之一，例如第四代CAR-T可以与白细胞介素12（IL-12）因子共表达至-12成为可能。它定位于靶点表达，改善免疫治疗微环境，并激活附近的自然杀伤（NK）细胞、浸润性T细胞等[8]。从而激活内源性抗肿瘤反应。通用型CAR-T细胞技术的研究将引入更多的基因编辑技术，最大限度地突破移植物抗宿主病（GVHD）的瓶颈，最终扩大CAR-T细胞技术的规模化发展。将为申请打下基础。
2. CAR-T结构组件研究
2.1 单链抗体研究
嵌合抗原受体CAR结构的第一个重要部分是膜外区的scFv，它特异性识别并结合VH-linker-VL或VL-linker-VH形式的肿瘤细胞表面抗原。目前能够特异性识别并结合抗原的最小分子是scFv[9]，其大小约为28KD。 scFv 可以与纳米球或多种已知的靶向治疗药物组合。直到CAR的发展，scFv的独特作用才再次引起人们的广泛关注。靶分子和修饰靶分子的亲和淘选是目前获得更特异的scFv片段分子的有效方法。其中，较常用的筛选方法包括DNA文库、噬菌体文库、核糖体展示文库等筛选文库技术。人源化抗体和亲和力优化也可应用于靶点选择，主要技术包括噬菌体抗体技术、嵌合抗体技术、基因工程抗体技术。 scFv 亲和淘选和靶点识别不仅可以利用肿瘤蛋白抗原，还可以利用糖脂非蛋白、碳水化合物或肿瘤特异性受体配体。目前，世界各地许多机构研究最多的靶点是特定或类型的肿瘤相关抗原。实体瘤的靶点选择主要涉及突变或病毒抗原、组织特异性抗原、组织发生特异性抗原、过表达抗原等[10]。综上所述，目前常用的研究对象有：
CD分化抗原系列： CD19（最常见）、CD20、CD22、CD30、CD33、CD107a、CD171、CD123、CD133、CD138、CD317等。
肿瘤标志物系列：CA125、CEA、AFP、PSMA；
表皮生长因子系列：Her-1、Her-2、EGFR等；
突变基因、酶等。GD2、间皮素、MAGE-A3、MUC-16、ROR-1、GPC3、DR5、TIPE3、MAGE-A3、IL-13Ra2、c-MET、CAIX等。
一些修饰靶点的研究，如表皮生长因子受体II型变异体（EGFRvIII），正在实体瘤中快速发展，用于治疗神经胶质瘤患者的临床试验正在进行中。EurekaTher-apeutics开发了一种专门识别HLA的产品-A02.“使用仅限于AFP 抗原多肽的人源化单克隆抗体研究人源化噬菌体文库。”随着研究的进步，一些新的肿瘤靶点也被提出。成纤维细胞激活蛋白在许多肿瘤的基质中高表达。靶向该蛋白的CAR-T 细胞可以抑制小鼠肿瘤生长，且无细胞毒性[12]。Tran 等人使用全基因组测序[13]，我们免疫学靶向具有抗原靶标突变（erbb2 基因突变）特征的肿瘤观察6个月内，患者病情得到控制，持续缓解。
在靶点选择和scFv设计方面仍存在许多问题需要解决，特别是在缺乏针对实体瘤的特异性靶点的情况下。在亲和力方面，增加CAR抗原亲和力可以提高肿瘤靶向性，同时伴随着抗原表达的下调和T细胞活化的增加，但高亲和力的CAR与抗原结合得太紧；效应T细胞最终反而与抗原结合。限制多个目标分子，限制它们的暴露，从而限制致命性。从功效角度来看，目前的研究项目主要针对已知且相对知名的肿瘤相关抗原，而肿瘤特异性抗原仍缺乏。抗原筛选的优化是实体瘤靶向领域的重要组成部分，但改变疗法可能导致肿瘤抗原呈递的下调和丧失，从而导致肿瘤免疫逃避。关于靶标破坏的进化选择，实体瘤可能存在大量靶标阴性细胞，因此靶标阴性细胞在杀死靶标阳性细胞后可能会增殖。一些研究指出，靶标阴性的肿瘤细胞只能通过唤醒浸润性T细胞来杀死。在鼠源方面，目前的CAR大多是基于鼠源抗体scFv设计的，这种异源模型具有诱导宿主抗CAR反应的潜力。人源化scFv 片段或使用人类抗体设计CAR 是防止这种反应的可能策略之一。此外，特定scFv的设计和获取也是一个相对漫长且迭代的筛选过程。
2.2 职业生涯设计研究
目前，应用最广泛的CAR-T细胞技术仍然使用病毒作为载体[14]，其中逆转录病毒和慢病毒仍然是最常见的。虽然两者都具有良好的基因转移效率，但慢病毒具有更高的感染效率、更持续的表达以及传递大DNA序列的能力[15]。其他病毒也得到了研究；例如，Pule等人[16]报道了利用Epstein-Barr病毒改造第一代CAR-T细胞的尝试，并取得了一些成果。以溶瘤病毒（OV）为载体的研究表明，溶瘤病毒可以选择性地感染肿瘤细胞，在肿瘤细胞内复制，并在不损害健康组织的情况下杀死肿瘤细胞，这一事实带来了显着的进展。负载OV的工程化T细胞可能代表一种可以提高疗效的新联合疗法[17]。在病毒载体的安全性方面，研究表明，装载低剂量病毒的CAR-T细胞不会影响小鼠或人类T细胞的受体表达或功能[18 -19]。病毒载体是否有可能引入有害的插入突变。
与病毒载体相比，质粒载体构建成本较低，且不整合到宿主基因组中，保证了安全性。然而，质粒载体的构建较为耗时，包括长期的体外培养和耐药性筛选过程，而人体对质粒载体中耐药基因的免疫反应限制了临床应用研究。从物理呈现和化学衍生的角度来看，电穿孔技术通用性强、安全性高，但效率低的缺点较为明显。全部用作传感器。载体研究，特别是第四代CAR-T细胞技术，迅速推进了遗传工具“睡美人”（SB）转座子系统[21-22]和Piggybac转座子系统[23]。
2.3 效应细胞设计研究
典型的CAR-T治疗过程包括T细胞分离、修饰、扩增、回输和监测，因此T细胞的获取、转化和培养是在CAR-T治疗的整个过程中进行的。 T细胞可以从自体或健康同种异体来源获得，但自体来源限制了质量规模，需要特定的患者条件，并且增加了治疗的成本和时间。当使用来自志愿者的T 细胞时，必须克服同种异体排斥。因此，基因编辑修饰逐渐在CAR-T细胞技术中得到发展和应用。英国研究人员使用TALEN基因编辑方法使T细胞中的两个关键基因失活。一种是T细胞上的独特识别基因，其失活可防止T细胞攻击肿瘤细胞以外的靶标，从而大大减少不必要的同种免疫反应。另一个是T细胞膜蛋白基因，其失活可以保护修饰的T细胞免受某些药物的破坏。这种免疫特性改变的T 细胞已成功用于治疗针对目标CD19 的晚期急性淋巴细胞白血病儿童[24]。因此，应用“基因编程”技术的同种异体CAR-T细胞技术或可解决CAR-T细胞的大规模生产问题。随着我们对T细胞了解的加深，更多的基因编辑技术将被用于改造它们。例如，TALEN基因编辑技术可以应用于T细胞，敲除TCR-基因（降低GVHD）和CD52基因（降低GVHD）。这些细胞对阿仑单抗（alemtuzumab）和RQR8（一种增加细胞对利妥昔单抗敏感性的自杀基因）具有耐药性。成功设计严格控制T细胞行为的“分子开关”这一突破性成果有望解决T细胞治疗后严重副作用的问题[7, 25]。
关于T细胞类型和注射方法，研究表明CD8+CAR-T细胞可以有效裂解肿瘤细胞，而CD4+CAR-T细胞可以促进大量细胞因子的产生。可以产生细胞因子。大量的IL-2 刺激CD8+ T 细胞[26]。含有CD4+T细胞和CD8+T细胞比例为1,333,601的混合细胞产品可以完全根除大型淋巴瘤[26]。 T细胞的修饰将是近年来效应细胞发展的方向之一[27]。用于CAR 免疫疗法的T 细胞的另一个来源是 T 细胞系列。此类T细胞的抗原识别不同于蛋白衍生肽，后者包括通过aTCR识别同种异体抗原，因此T细胞同种反应性较低，但具有更好的抗肿瘤功效[28]。一般来说，患者在输注T细胞之前必须进行预处理，主要是通过调整化疗来延长过继性T细胞的停留时间。出于安全考虑，凯特林癌症研究中心在化疗后第二天适应性调整T细胞，但美国国家癌症研究所建议，对于晚期B细胞淋巴瘤，我们认为小剂量化疗联合CAR-T疗法更有效。目前，重组T细胞的回输方式主要是静脉注射，虽然大多数使用腹腔或肿瘤注射的研究仍处于实验阶段，但微创干预或瘤内注射可能使CAR-T细胞能够侵入实体内部。有效杀伤靶细胞可能是实体瘤CAR-T疗法的未来方向之一。
嵌合抗原不仅可以修饰T细胞，还可以修饰效应细胞，例如细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和NK [28]。 Chu等人[29]在多发性骨髓瘤（MM）、CAR-NK细胞以及利用CAR-NK细胞靶向CS1靶点的CAR-T细胞治疗的体外和体内实验研究中取得了突破性进展，取得了显着的疗效。产生IFN-等影响因素。 NantKwest拥有以NK细胞治疗为核心的三大技术平台：aNK、haNK、taNK。 NK 不表达杀伤抑制受体（KIR），这可以防止NK 活性被靶细胞表面的MHC 抑制。一些研究探索了用CAR-T对造血干细胞进行基因改造的可能性，并且在HSCT期间使用此类CAR-T可能特别有益。
3.临床应用研究
CAR-T细胞技术在治疗难治性和复发性急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征（MDS）等血液系统恶性肿瘤方面显示出巨大潜力，是目前唯一有前景的治疗选择。不依赖同种异体HSCT治疗血液恶性肿瘤也是通往移植的重要桥梁或者是清除移植后残留肿瘤细胞的重要武器。 Porter等[30]使用CLT019治疗晚期慢性淋巴细胞白血病患者，取得了67%的6个月无进展生存率，持续缓解期超过10个月，最长完全缓解期达到2年年。特异性靶向CD19分子的CAR-T细胞技术可以有效治疗急性B细胞恶性肿瘤。 16名接受治疗的患者的完全缓解率为88%。大多数患者在接受CAR-T细胞技术治疗后可以治愈。继续HSC移植[31]。 CTL019在治疗某些类型的难治性非霍奇金淋巴瘤方面显示出独特的潜力。诺华公司公布了15 名可评估的弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBCL) 成年患者和11 名滤泡性淋巴瘤(FL) 患者接受CTL019 治疗3 个月后的1 期临床研究数据。结果显示，r/rDLBCL患者组的总体缓解率为47%（n=7/15），FL患者组的总体缓解率为73%（n=8/11）[32]。几项已发表的研究分析表明，患有骨髓内明显肿瘤侵犯的血液恶性肿瘤患者更有可能获得缓解[30]。本研究发现，中枢神经系统白血病（CNSL）患者脑脊液中的白血病细胞经过CAR-T治疗后得到有效清除。研究表明，输注的CAR-T细胞可以在患者外周血和骨髓中大量存活，保持有效清除功能6个月以上，并且存在部分CAR-T细胞[34-35]。以记忆效应细胞的形式。 CAR-T细胞可能为CNS-L、原发性CNS-L和脑肿瘤的治疗提供新的治疗方向。
实体瘤的研究也取得了一些令人满意的结果。研究发现，采用针对间皮素蛋白设计的CAR-T细胞技术治疗的胰腺癌动物平均生存期为96天，比对照组54天的平均生存期高出78%[36]。间皮素在三阴性乳腺癌和肺癌中也高表达，CAR-T细胞技术在这两个领域的应用正在探索中。 2015年美国临床肿瘤学会年会上，公布了CAR-T细胞技术治疗实体瘤胰腺癌的首次突破性成果，六分之一的受试者出现部分转移，肿瘤消失，肿瘤代谢稳定四个病人。或减少，并且发现相应的CAR-T细胞已转移至患者的肿瘤部位[37]。在19 例复发或转移性Her-2 阳性肉瘤患者中进行的HER2-CAR T 细胞治疗I/II 临床试验中[38]，细胞在CAR-T 治疗实体肉瘤后没有表现出明显的毒性。存活了6周多。它是有效的，患者中位生存期为10.3 个月（范围5.1 至29.1 个月）。在两名接受测试的患者的肿瘤组织中检测到了CAR-T 细胞。在17例可评估患者中，4例患者病情稳定3至14个月，3例患者肿瘤被切除，1例患者临床疾病>90%肿瘤坏死，观察身体症状。
4. 有毒物质和副作用以及技术缺陷
4.1 细胞因子释放综合征
CAR-T细胞技术临床应用中最重要的副作用之一是细胞因子释放综合征（CRS），主要原因是CAR-T细胞技术在短时间内消灭了很多癌细胞，是产生大量的癌细胞。细胞因子，从而诱导免疫反应。同时，T细胞大量增殖引起细胞因子的释放，引起发热、肌痛、低血压、呼吸衰竭等症状，严重时可危及生命[39]。多项研究观察到CRS 与疾病进展和肿瘤负担相关，疾病负担高的患者通常表现出更多的细胞因子释放。一般来说，第二代和第三代CAR更容易诱导自身抗原并导致致命的CRS。通过严格遵循I期临床试验（攀登试验）的增量方案并在起始剂量中选择较少数量的T细胞，可以防止快速而严重的毒性反应。此外，使用IL-6 受体拮抗剂托珠单抗和激素预防可以减轻这种症状[31]。请注意，激素脉冲会降低CAR-T 的有效性。
4.2 靶向/脱靶毒性
与CAR疗法相关的毒性主要是由肿瘤相关抗原特异性T细胞对患者正常组织中低表达自身抗原的“脱靶”识别引起的。例如，低丙种球蛋白血症，这是由于细胞中的CD19分子被靶向而引起的。这也是CAR-T细胞后续过继反应的间接证据[31, 33]。此外，在治疗过程中，5%~10%的患者仍然缺乏CD19抗原，从而逃避CD19-CAR-T细胞的识别和杀伤，导致治疗脱靶。此外，针对Her-2 的CAR-T 细胞疗法可能会对肿瘤部位以外的其他组织或器官造成攻击，包括可能的心肺毒性[39]。
4.3 神经系统毒性和其他细胞毒性
CAR-T治疗白血病可引起多种神经系统症状，如谵妄、语言�**⒃硕**⒊聊ⅰⅠ拆锓⒆骱透涡阅圆〉萚31-32]，有些症状可能会自行缓解。还有关于CAR-T引起自身免疫性疾病风险的报道。多项儿科CAR-T 治疗研究中观察到巨噬细胞活化综合征[39, 49]。
4.4实体瘤治疗疗效低
目前最成功的CD19-CAR-T在恶性血液病方面取得了良好的效果，但对实体瘤的治疗效果不足。实体瘤治疗的主要问题是：
CAR-T细胞静脉输注后，需要寻找实体瘤特异性抗原，避免侵入正常组织，使T细胞能够返回肿瘤位置。
CAR-T要发挥作用，必须侵入实体瘤，但即使在侵入肿瘤后，内环境中的浸润性调节性T细胞（Treg细胞）、肿瘤相关巨噬细胞和程序性死亡配体PD-L1也会升高. 表达并且是抑制性的。细胞因子（如白细胞介素10、TGF）可以抑制不同类型的T 细胞，从而杀死它们。
CAR-T细胞还高度表达程序性死亡受体PD-1。最近的临床试验在实体瘤，特别是胰腺癌和肉瘤方面取得了积极进展，再次证实了CAR-T 细胞可以迁移到实体瘤内部和周围[36-38]。一些研究认为，修饰的T 细胞还可以表达次级CAR [29]，从而更有效地将它们定位到疾病部位。克服实体瘤治疗效果低的临床试验正在进行中，针对晚期和治愈不佳的实体瘤的临床试验可能会取得良好进展。
4.5 其他
由于CAR-T需要对每位患者进行个体化治疗，存在治疗费用高、疗效不确定不稳定等问题[40-41]。不同中心的CAR-T临床试验结果不一致，规范化治疗还有很长的路要走。 CAR-T治疗后的复发也需要引起重视，需要进一步研究其长期疗效和安全性。
五、总结与展望
CAR-T细胞技术可能是最快从实验室走向临床应用的技术，极大促进转化医学的发展。与化疗药物和分子靶向药物相比，CAR-T更具针对性，通过技术改造可以实现多个靶点。免疫靶向治疗的几个优点可以帮助治疗一些预后极差的罕见肿瘤。随着未来技术的成熟、CAR成分的进一步细化以及治疗成本的逐步下降，有理由相信CAR-T细胞技术很可能成为医院和门诊的常规治疗。此外，CAR研究并不局限于肿瘤；CAR-T细胞技术具有攻克疑难杂症的潜力，比如针对HIV等病毒的治疗研究，目前疑难杂症的治疗是一个瓶颈[42]]。
CAR-T细胞技术的升级正在不断研发中，各个组成部分的进步可能会带来更多的临床益处。近年来生物技术的快速发展也是CAR-T细胞技术成熟的推动力。相信更多的生物技术将会投入到肿瘤免疫疗法的研发上，认为未来的肿瘤治疗希望一定是建立在以免疫疗法为基础的联合疗法之上。通用型CAR-T的开发是大规模临床应用的课题，即利用正常第三方细胞衍生的T细胞，通过敲除内源性TCR来产生同种异体TCR诱导的移植物，有可能解决消除主机的问题。可以抑制遗传性疾病，进一步提高CAR-T的肿瘤杀伤效率[43-44]。产生双特异性接头分子的CAR-T（ENG-CAR-T）细胞具有更强、更持久的抗肿瘤作用[45]。多靶点CAR-T细胞技术在临床前实验中显示出更有效的抗肿瘤作用[46]。
干细胞技术的进步将进一步增强CAR-T疗法。癌症干细胞是肿瘤复发的根本原因，针对癌症干细胞的靶向治疗的设计可以预见将是未来另一个重要的研究方向[47]。此外，记忆T细胞的筛选，特别是中枢记忆T干细胞的研究将得到进一步应用。 Themeli等人[48]率先利用诱导重编程干细胞（iPSC）技术获得T干细胞来靶向肿瘤细胞。在这项研究中，我们从正常外周血中收集了T 细胞，并通过逆转录病毒将其转移。
以诱导方式引入OCT-4、SOX2、KLF4 和c-MYC，将T 细胞重编程为T-iPSC，然后通过慢病毒载体将编码CD19 的CAR 的靶基因片段转导至T-iPSC。进入iPSC 并进一步诱导它们。分化为共表达CDI9-CAR 和内源TCR 的幼稚T 细胞。
[第一作者]赵琳，女，博士研究生，研究方向：肿瘤侵袭转移相关基因基础研究。
[通讯作者]赵新汉，男，二级教授，主治医师，科研指导，肿瘤相关基因基础与临床研究。
【基金项目】国家自然科学基金综合项目（81672626）
[参考] 略
（来源：中国合理用药）