免疫细胞的培养，免疫细胞培训
chanong
|免疫细胞培养有六个基本流程：样品制备、细胞分选、分型与鉴定、扩增与培养、质量优化、随访。今天我们继续一起学**质量优化。质量优化：针对制备单细胞悬液时产生的细胞团块和碎片、细胞增殖和培养过程中的支原体和内毒素影响等不良因素，我们将积极采取措施解决这一问题。 1. 优化单细胞悬浮液的质量：这部分研究参见《工欲善其事，必先利其器---单细胞悬液质量优化》。 2、优化细胞培养质量：在细胞培养过程中，必须不时进行支原体和内毒素的检测，但即使不小心“教”了，也可以及时防止损失。支原体是一种原核微生物，在细菌和病毒之间没有细胞壁。 （一）形态特征支原体尺寸极小，为0.10.3m，无法用光学显微镜观察或用0.22m滤膜过滤，常规抗生素一般无效。支原体在培养基中可以寄生、共存、独立生存，98%的支原体吸附在细胞膜或细胞间隙上。 （2）污染源支原体阳性细胞相互污染；支原体是垂直传播，一旦污染，下一代细胞就会被支原体污染。 口腔、唾液等。培养基混合、防护不当等**惯也可能是支原体污染源；工作环境等培养条件不完善，培养设备清洗消毒不充分。消耗品也会增加支原体污染的风险。 （3）对细胞研究的影响抑制细胞增殖、代谢，杀死细胞：正常情况下，轻度支原体污染对细胞增殖无明显影响，但细胞生长随着营养物质的消耗而改变。慢慢地，支原体还可以感染细胞，利用其生物合成机制抑制关键代谢途径，最终导致细胞增殖抑制和死亡[1]；染色体异常、核酸合成受损和DNA断裂：支原体可以与细胞核相互作用细胞。酸引起染色体结构改变，影响DNA合成，维持染色体完整性，例如支原体感染模拟shRNA介导的p53敲除，允许Ras转化，从而破坏p53功能[2]；改变细胞膜的抗原性：支原体相互作用与参与炎症和细胞转化的细胞通路发生关系，例如支原体蛋白与TLR相互作用并进入细胞，从而改变参与炎症和DNA修复的多个通路[3]；转染效率的变化：支原体可以影响内部细胞。基因转运和表达机制减慢或干扰DNA转染效率[4]；增加对凋亡诱导剂的敏感性：支原体通过特定蛋白质控制凋亡途径的关键分子，相互作用可以增加细胞对凋亡诱导物质如作为NAE 和支原体酶MGA-0676 诱导DF-1 细胞凋亡[5]。 (4)支原体预防：支原体污染的防治也很重要。例如，支原体检测应每1 至2 周进行一次。在冷冻保存之前和开始任何关键培养之前，应对新到达的细胞系进行支原体检测。实验，检测。保存并学**10个预防支原体的技巧（图1）。
图1 预防支原体污染的10个技巧
姓名
项目编号
特征
MycoZap 预防
VZA-2031
支原体预防剂（优质进口产品）
支原体预防剂
ABS9376
支原体预防剂（国产，便宜）
表1 防止支原体污染的试剂（5）支原体检测方法：支原体检测方法有很多种，小友也总结了各种方法的原理、优缺点（表2）。
表2 支原体检测方法比较
姓名
项目编号
特征
MycoAlert 检测试剂盒
LT07-318
支原体检测试剂盒（优质进口产品）
MycoAlert PLUS 检测试剂盒
LT07-710
支原体检测试剂盒（高品质、高灵敏度进口产品）
支原体检测试剂盒（PCR法）
ABS9588-50T
支原体检测试剂盒（国产，成本低）
表3支原体检测试剂盒（六）支原体去除：目前去除支原体最有效的方法是使用支原体清除剂，但其他清洗纯化方法（离心力、细胞、微生物等）也有方法（利用支原体的差异）悬浮液的浮力）。您还可以尝试使用支原体特异性血清（用于去除支原体）或支原体特异性血清。
姓名
项目编号
特征
Mycozap 5 治疗套件
LT07-918
支原体去除试剂（优质进口产品）
支原体清道夫
ABS9375-200L5
支原体清除剂（国产，性价比高）
表4 支原体去除试剂内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的成分，其化学本质是脂多糖（LPS），单位为Eu/mg或Eu/U。 1 EU 相当于每mL 溶液约0.1-0.2 ng 内毒素。仅当细菌被杀死、裂解或人为破坏时才会释放内毒素。 （1）特性：内毒素极耐热，除非在160加热24小时或在强碱、强酸、强氧化剂中煮沸30分钟，其生物活性不会被破坏。 (2) 污染源： 制备各种试剂和缓冲液的水 与各种培养基、血清和添加剂“混合” 塑料器皿、玻璃器皿和其他表面(3) 对细胞的影响： 细胞功能变化：内毒素可以刺激某些细胞分泌炎症因子，引起局部炎症反应。例如，用低至0.5 ng/mL 的内毒素处理6 小时可以增加马腹膜巨噬细胞中IL-6 的分泌[6]。 -细胞健康：内毒素可促进细胞衰老、凋亡，甚至死亡；激活细胞：在单核细胞存在的情况下，100 ng/mL内毒素可促进人T细胞增殖和淋巴因子产生[7]；降低细胞转染效率真核细胞系：纯化质粒DNA中的内毒素会降低所有细胞系的转染效率和活力。内毒素含量（10 EU/g）会影响标准细胞系的转染、蛋白质和蛋白质含量。和活力受到负面影响[8]。 （4）内毒素的预防：选择优质/低内毒素培养基、血清、试剂等耗材。培养免疫细胞时，可以选择免疫细胞专用的无血清培养基。构建系统时应选择低内毒素血清和基础培养基；同时免疫细胞培养过程中添加的生长因子也应是高质量、低内毒素的；可重复使用的实验耗材，可高温处理高压：250，30分钟或180，3小时； 细胞培养用水的水质也很重要，赛多利斯的迷你净水器可满足实验室每天消耗15ml的纯化水/可填充超纯水与所有的细胞宝宝一起； 此外，培养过程中制备的一些缓冲液可以过滤和灭菌，因此可以在添加到细胞之前去除潜在的内毒素。
姓名
项目编号
特征
澳大利亚胎牛血清
SV30208.02
它用于难以收集的有价值的细胞，例如原代细胞和干细胞。
新西兰胎牛血清
SH30406.05
X-VIVO10
04-380Q
含有庆大霉素、酚红
X-VIVO15
04-418Q
X-VIVO20
04-448Q
纯水/超纯水一体化装置miniplus
H2O-MA-UV-T
3级纯水和1级超纯水的生产
表5 内毒素预防相关产品（5）内毒素检测：小友还整理了各内毒素检测方法的原理、优缺点（表6）。常见的方法有鲎试剂法和重组C因子法，但由于鲎属国家二级保护动物，无法大规模使用。因此，我们推荐使用重组C因子（rFC）方法进行内毒素检测。
表6 内毒素检测方法
姓名
项目编号
应用
PyroGene 192 测试套件
50-658U
内毒素检测试剂盒（重组C因子法）
表7 内毒素检测试剂盒（六）内毒素去除：目前还没有有效的方法去除细胞培养物中的内毒素，所以小友建议大家做好防范。参考文献： 1.Netto, Cristiane et al. [巴西微生物学会出版物] vol. 45,4 1513-9. 4 Mar. 20152.Logunov, D Y et al Oncogene vol. 27,33 (2008): 4521 - 31.3.Benedetti, Francesca 等人“支原体-宿主相互作用： 炎症机制及其与细胞转化的关联”微生物卷8,9 1351. 20204 年9 月4 日.ying, Zi-Fei 等人“支原体污染介导的衰减” HEK-293 细胞中缺乏L-精氨酸可提高质粒DNA 转染效率。 《浙江大学学报. Science. B vol. 20,12 (2019): 1021-10265. Li, Peng et al. 《细胞凋亡机制》《鸡胚成纤维细胞中支原体核酸酶MGA-0676 的诱导》《细胞前沿》微生物学与感染”第8 卷105。2018 年4 月4 日6. Morris, D.D.Crowe, N.Moore, J.N. 和Moldawer, L.L. 马腹膜巨噬细胞体外内毒素诱导的白细胞介素产生6。Am. J. Vet。 Res.53:1298-1301（19927。Mattern, T.Thanhauser, A.Reiling, N.Toellner, K.Duchrow, M.Kusumoto, S.Rietchel, E.T.Ernst, M.Brade, H. Flad, H.D. 和Ulmer, A.J. 内毒素和脂质A 在自体单核细胞存在下刺激人T 细胞的增殖。J.Immunol. 153:2996-3004(1994) 8 Butash, KA 等人(2000) 重新审视效果内毒素对细胞增殖和转染效率的影响。生物技术29(3): 610-614, 616, 618-619