致敬那疯狂的肿瘤免疫40年！免疫细胞与癌细胞融合，让小鼠表达人的抗体，只是为生产更好的抗癌药丨奇点深度

长期以来，如果我们打开人类的抗癌药物库，就会发现手术、放疗、化疗占据了主要地位。然而上个世纪，随着人类与癌症的斗争深入、战斗加剧，这些主力在战场上的表现似乎有些“压倒性但不足”。

但上帝也为人类打开了一扇窗。科学家对人体免疫系统的认识逐渐成熟，能够单枪匹马对抗各种疾病的有力武器其实“远在天边，却又近在咫尺”。如何利用免疫武器成为20世纪70年代左右的一个重要研究课题。

免疫细胞（图片来源：David Mark Pixabay）

1975年，在英国剑桥大学工作的阿根廷科学家Csar Milstein[1]和德国科学家Georges J.F. Khler[2]将正常B细胞和骨髓瘤细胞融合，创造了独特的杂交瘤技术[3]，获得了能够持续产生抗体的杂交细胞，是利用人类免疫系统的起点。

在米尔斯坦和科勒获得诺贝尔奖的同一年[4]，淋巴瘤治疗的理想靶点被确定。 1997年，以CD20为靶点、治疗复发或难治性缓慢进展淋巴瘤的人-鼠嵌合单克隆抗体利妥昔单抗获批上市，成为第一个获批上市的抗癌单克隆抗体，开辟了癌症治疗的新路径。

此后，随着科学家研究癌症基因组学，更多的靶点被发现，新的抗癌抗体不断出现。最激动人心的转折发生在2011年，全球首个免疫检查点抑制剂伊匹单抗获批临床，开启了癌症免疫治疗时代。

从杂交瘤技术诞生到2014年全球首个全人源PD-1单克隆抗体nivolumab获批，历时40年。

抗癌抗体技术从鼠源、人鼠嵌合、人源化发展到完全人源化，经历了数次激动人心的创新和升级，提供当今安全高效的肿瘤免疫疗法已经成为现实。

接下来就让起点炮来详细讲述它不可思议的40年。

来自小鼠的单克隆抗体：“一旦被蛇咬过，你就会害怕蛇10年。”事实上，直到1890年代才发现抗体的存在。科学家和医生对其识别病毒、细菌、真菌甚至寄生虫的能力垂涎三尺。经过长期研究，科学家在20世纪60年代发现只有淋巴细胞才能产生抗体[2]。

B细胞释放抗体

为了让大家对抗体有更直观的视觉感受，抗体图通常画成字母“Y”的形状。您可以看到该抗体由两种颜色组成。蓝色部分称为恒定区，这个区域相对“保守”，在很多不同的抗体中都是一模一样的。

黄色区域称为可变区域。该区域不断变化，没有两种抗体具有相同的可变区，这决定了抗体的特异性。抗体识别病毒、细菌和癌细胞的能力取决于该可变区。

抗体图

如今，人体的免疫系统含有数千亿个“免疫卫士”——个淋巴细胞，约占体重的1%，能够产生数以百万计的特异性抗体，我们已经知道能够与其相应的抗原充分结合。 [5] 与侵略者作战。

科勒和米尔斯坦发明生产单克隆抗体的技术三年后，37岁的日本分子生物学家利根川进发现了B细胞产生抗体多样性的机制，并不断变化，现在有可能找到“合适的抗体”。抗体中的候选者”。成为可能[6]。

但新的问题出现了。单克隆抗体制造过程使用未修饰的小鼠B 细胞和小鼠骨髓瘤细胞来制备杂交瘤。然而，如果将小鼠产生的鼠源抗体直接用于人体，人体免疫系统可能会消除作为抗原的鼠源抗体[7, 8]，导致不仅疗效低，还会出现安全问题。 [9]。

尽管存在上述风险，第一个单克隆抗体药物muromonab CD3（OKT3）还是于1986年获得FDA批准。由于OKT3源自整只小鼠，因此具有高度免疫原性，50%的治疗患者产生了抗OKT3抗体，显着降低了治疗效果[9]。此外，OKT3还会引起类似细胞因子风暴的过敏反应，这极大地限制了OKT3的临床应用。

OKT3获批近10年来，FDA尚未批准任何其他单克隆抗体药物上市销售，单克隆抗体药物的研发也陷入停滞。

人鼠嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体：从“伪装”到“伪装” 事实上，OKT3的命运可以说正如科学家预测的那样。这是因为，大约在同一时间，许多科学家正在绞尽脑汁地阻止小鼠源性抗体作为外来抗原被人体消除。

最终，他们成功了。

读完我们之前对抗体的介绍，您一定了解到，能够根据抗原“因地制宜”的高度定制的可变区对于抗体特异性至关重要。这就像抗体上的导航系统，决定抗体攻击谁。

于是科学家们认为，只要将小鼠抗体的可变区移植到人抗体的恒定区上，就可以显着降低抗体的免疫原性。这个想法终于在1984年实现，当时科学家能够“提取”识别特定抗原的小鼠抗体的可变区，并将其“结合”到人类抗体的恒定区上。 [10]

然而，面对不断争夺每一分钱的人体免疫系统，“戴着鼠源帽子”的人鼠嵌合抗体仍然十分引人注目，很容易被斥为“犯罪分子”。它发生的可能性。因此，随着人们对抗体可变区认识的加深，在识别特定抗原中起重要作用的可变区片段被发现，科学家们正在对源自小鼠的抗体使用更精密的“假手术”技术。能够做到这一点。

各种抗体结构图

1986年，琼斯及其同事“切掉”了小鼠单克隆抗体可变区的主要识别区域，然后简单地将这些可变区片段替换为人类抗体。这就是现在我们常说的人性化。派姆单抗(Pembrolizumab) 是该类型的另一种人源化抗体，在纳武单抗(nivolumab) 之后不久获得批准。

然而，无论是人鼠嵌合抗体还是人源化抗体，都是科学假设与实际困难之间妥协的结果。无论小鼠蛋白的比例多低，甚至不到抗体总量的10%，也无法完全避免进入人体后引起免疫排斥或过敏的风险。这种“头部替换技术”或“伪装技术”极不可能消除大鼠衍生部位的免疫原性。

唯一的机会是整个人类。

然而，通用人力资源说起来容易做起来难。当米尔斯坦和科勒的杂交瘤技术获得成功后，许多科学家尝试将人类B细胞与骨髓瘤细胞融合，生产全人类单克隆抗体药物。然而，几乎所有的尝试都是徒劳的，没有人能够将两者整合起来[11]。

全人源单克隆抗体：噬菌体展示和酵母展示“小屋装配线”的新曙光出现在20世纪70年代，重组DNA技术的建立和发展打破了不同生命体之间的“物种维度壁垒”。它。美国密苏里大学教授乔治·史密斯经过10多年的奋斗，于1985年独立研发出噬菌体展示技术[12]。

五年后，剑桥大学的Gregory Winter团队利用噬菌体展示技术获得了正确折叠且功能完整的人类抗体片段[13]，也就是前面介绍的黄色可变区，我成功地做到了。通过使用分子生物学技术简单地将这个最重要的部分移植到恒定区中[14]，就创建了全人源抗体。

噬菌体（图片由Clker-Free-Vector-Images 在Pixabay上提供）

那么噬菌体展示技术是如何产生和筛选抗体可变区的呢？首先给噬菌体赋予人体内制作抗体可变区的基因，然后噬菌体指导大肠杆菌——产生各种抗体的可变区，形成一个巨大的“抗体可变区库”。然后使用目标抗原从该文库中“捞出”可以与特定抗原结合的抗体的可变区。

然而，噬菌体展示技术的缺点也很明显。抗体蛋白的修饰和折叠与人类细胞的修饰和折叠显着不同[15]。一定程度上影响抗体可变区与抗原的亲和力。

在癌症治疗中，研究表明，随着抗体亲和力的增加，治疗效果也会增加[16]。然而，通过噬菌体展示技术获得的抗体可变区的亲和力通常不足以有效治疗肿瘤[17]。因此，通过噬菌体展示技术获得的抗体往往需要手动优化[18]。

噬菌体筛选示意图

为了解决噬菌体展示平台面临的问题，K. Dane Wittrup及其同事推出了基于真核酵母的酵母展示平台[15,19]。信迪利单抗是基于该平台开发的PD-1单克隆抗体，去年底在中国获批上市。

虽然酵母展示平台已经从原核表达系统向真核表达系统取得了进展，但酵母蛋白修饰系统与人体之间仍然存在较大差距[20]，这就是为什么抗体的功能性也有一定的影响。这种差异在一定程度上限制了酵母展示平台的应用。

据统计，截至2017年5月，全球FDA批准销售的全人源单克隆抗体药物共有23个，其中6个抗体是通过噬菌体展示技术推出的，0个抗体是在酵母展示平台上推出的，其余17 个均来自有前途的转基因小鼠平台[21]。

全人源抗体领域的真正变革是基因工程小鼠的诞生。

全人单克隆抗体：转基因小鼠带来真正的、完整的人性在史密斯推出噬菌体展示技术的同一年，现为美国国家科学院院士的弗雷德里克·阿尔特（Frederick Alt）和几位前同事大胆预测了以下内容： “人类抗体可以在日益成熟的转基因小鼠中表达”[22]。

这一预测指出了未来几十年的研究方向，越来越多的团队加入基因工程小鼠的行列[23, 24]。研究的顶峰是在1997 年。日本麒麟啤酒株式会社的Isao Ishida领导的10人研究小组[25]已基本实现了将人源抗体产生系统移植到小鼠体内。巧合的是，石田勋是我之前介绍过的1987年诺贝尔奖获得者利根川进的学生。

在接下来的几年里，各个科研团队合作，最终创造出了达到人类免疫系统水平的转基因小鼠。

鼠标（图片由Robert-Owen-Wahl Pixabay上的）

与噬菌体展示和酵母展示平台不同，转基因小鼠平台生产抗体的方法是首先破坏小鼠的免疫系统，然后将编码抗体的人IgG基因引入小鼠体内，在小鼠体内产生抗体，从而最大限度地提高产量。产生人类IgG 抗体的人类抗体生产系统。从这一点来看，它比上面提到的两个平台都要好。

另一方面，为了维持抗原可变区的多样性，噬菌体展示和酵母展示依赖于人为引入的突变，而转基因小鼠则依赖于B细胞的天然自主体细胞，它使用的是超突变。理论上，小鼠是数百万年进化的产物，引入突变的方法比人工方法更好。

酵母展示平台的发明者Whitlup 和其他科学家分析了每一种已批准销售且处于2 期或以上临床研究的单克隆抗体。他们发现转基因小鼠开发的抗体药物比噬菌体展示具有更高的药物发现潜力[26]。

单克隆抗体发展史

我们以前面介绍的nivolumab为例，简单分解一下如何利用转基因小鼠平台创建全人源单克隆抗体。

首先，用PD-1免疫转基因小鼠，当小鼠B细胞受到人类PD-1抗原刺激时，它们启动体细胞超突变程序并增殖，产生数以万计的B细胞，并分裂成细胞。不同的人类抗体。接下来，利用Koehler和Milstein发明的杂交瘤技术，他们将从PD-1免疫的小鼠中分离出B细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合。最终，经过层层筛选，找到了对PD-1亲和力最高的人源抗体杂交瘤。

回顾人力资源富集的“所有路径”，转基因小鼠平台的出现比噬菌体展示技术晚了10年，与酵母展示平台几乎同时出现，但它们以多种方式提供了多种优势。批准销售的全人单克隆抗体数量最多。

转基因小鼠产生全人源抗体示意图

正如著名免疫学家Sefik S. Alkan所说，单克隆抗体的发现改变了生物医学的面貌，并可能在未来几个世纪深刻影响我们的生活[2]。

从1975年到2014年这40年里，无数科学家的不断努力，不仅改写了人类癌症医学的历史，而且无疑将在未来数百年里改变人类的健康。

我要向这40年致敬，这40年充满了不知疲倦和疯狂的实验，这些实验始于一个疯狂的想法，但疯狂的背后却是对科学的勇气和坚韧。

编辑神：曹琪点教如何识别单克隆抗体

最后，我们将向您展示如何快速识别单克隆抗体的类型。

单克隆抗体名称中的后缀mab代表单克隆抗体，mab前的1-2个字母包含单克隆抗体的命名规则（o代表小鼠源抗体，xi代表小鼠源抗体等）。一种嵌合抗体，zu是人源化抗体，只有一个u是全人抗体。

参考：

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[3].Kohler G, Milstein C. 分泌预定义特异性抗体的融合细胞的连续培养[J]. Nature, 1975, 256(5517): 495-497. DOI: 10.1038/256495a0

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本文作者| BioTalker

“我无法冷静。”