ros1融合基因突变，融合基因rt-pcr检测

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近年来，随着肺癌分子生物学机制研究的深入和靶向治疗的发展，除了众所周知的EGFR、ALK等基因突变外，在肺癌中还发现了10余种驱动基因。ROS1，罕见的驱动基因也逐渐开始引起人们的关注。 ROS1突变主要是由ROS1基因与其他基因的截短或融合引起的，主要发生在NSCLC（非小细胞肺癌）中，阳性率约为1%~2%[1]。 ROS1融合阳性NSCLC年轻（中位年龄49.8岁），大多数为女性，从不/轻度吸烟者，主要组织学是腺癌[2]。成功检测ROS1融合基因是合理治疗的关键，也是个体化治疗的前提[3]。目前，针对ROS1融合基因有四种方法：荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和新一代测序技术。常用。 （NGS）[4,5]，在临床实践中各有其优点和缺点。

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FISH 是目前检测肿瘤组织染色体重排最有效的诊断技术之一。不仅可以检测已知的融合突变，还可以检测未知的融合突变，结果可靠、稳定。这也是最有效的诊断方法之一。它是目前用于测试其他检测技术的技术，也是提高准确性的最重要手段。 ROS1融合基因的检测采用单独的探针试剂设计。 ROS1分离探针由两部分组成：一部分识别分离点（端粒）5'端附近的基因序列，另一部分识别融合分离点（着丝粒）3'端附近的基因序列。确定基因序列。通常，3' 末端探针标记为绿色，5' 末端探针标记为橙色或红色。如果样品中15% 或更多的细胞表现出分离的信号形式（分离的红色和绿色信号）或单个3' 信号形式（仅绿色信号），则诊断为ROS1 基因融合阳性。然而，该方法的广泛应用受到检测成本高、需要专门设备和人员、昂贵的试剂以及快速荧光信号衰减等缺点的限制。

图1a显示ROS1基因融合阴性形态（正常：红绿信号融合），图1b显示ROS1阳性分离信号形态（红绿信号分离），图1c显示ROS1阳性单个3'信号形态（绿色的）。仅信号）[6]。

逆转录聚合酶链反应

RT-PCR检测因其灵敏度高、特异性强、简便、快速等特点，在实验室中应用更为广泛，能够检测所有融合类型，但无法区分融合类型。目前，ROS1 PCR检测大多数采用实时RT-PCR技术。实时RT-PCR技术将RNA逆转录成cDNA和基于荧光的定量PCR扩增结合起来，首先RNA在逆转录酶和特异性引物的作用下逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板添加片段。模板。该技术在PCR反应体系中添加荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后利用Ct值对未知模板进行定性定量分析，是一种直接进行PCR反应的方法。检测基因融合。情况。目前，国家食品药品监督管理局（NMPA）已批准多款ROS1阳性NSCLC实时RT-PCR诊断试剂盒，其中包括厦门艾德生物医学科技有限公司的人ROS1基因融合检测试剂盒（RT-PCR） 。 正在做。法）和武汉友之友科技有限公司的人ROS1基因融合检测试剂盒（RT-PCR法）[4]。图2为爱德生物的人ROS1基因融合检测试剂盒（RT-PCR技术），适用的检测样本包括新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织等[7]

免疫组化

IHC可作为ROS1融合基因的常规筛选方法。与FISH技术相比，IHC成本更低、速度更快、更准确，临床应用更广泛。 IHC 测试使用显色试剂来标记抗体，并利用免疫反应的特异性来确定抗原。在NSCLC患者中，目前可用于ROS1融合基因筛查的主要抗体是D4D6（Cell Signaling Tech），ROS1融合蛋白的检测灵敏度和特异性已分别达到100%和85%-100%。由于ROS1检测采用IHC，操作方法和判读标准不规范，导致各个检测实验室的检测结果存在较大差异。我国对《ROS1阳性非小细胞肺癌诊断病理专家共识》的评价标准为：IHC 3+: 10%肿瘤细胞呈强深棕色染色；IHC 2+：10%肿瘤细胞呈棕色染色IHC 1+: 10%肿瘤细胞呈弱深棕色染色棕色染色，无背景染色；IHC 0：无明显染色或10%或更少的肿瘤细胞有弱棕色染色[4]。强阳性IHC检测与阳性RT-PCR/FISH检测之间存在高度一致性，但中度阳性和弱阳性与阳性RT-PCR/FISH检测之间不存在一致性。对于IHC 1+或更高的患者，建议使用RT-PCR/FISH来明确ROS1融合基因的诊断。图3：强烈的深棕色染色(IHC 3+) 以及ROS1 FISH 测试阳性（红色和绿色信号分开）[8]

NGS

NGS又称高通量测序，广泛应用于医学领域的肿瘤预防、检测和治疗，可以准确检测已知基因和其他基因的突变。 NGS分为基于DNA的NGS或基于RNA的NGS、基因扩增NGS和杂交捕获NGS，是一个复杂的操作过程，包括杂交捕获、文库构建、测序、数据分析和变异注释等处理。虽然NGS对操作人员和操作环境要求较高，检测周期较长（覆盖不同数量基因的检测panel可能需要3至10天出报告），但NGS检测技术具有以下特点：具有不可替代的优势。一个样本由于获得多个基因检测结果，需要多个技术平台和多个样本。虽然NGS可以检测未知的基因突变，但传统检测技术无法检测未知的融合。与传统基因检测方法相比，NGS检测具有明显的技术优势。然而，传统的基因检测方法由于其临床可及性和每次检测成本较低而广泛应用于临床应用[9, 10]。

在临床实践中，有效、规范地应用现有检测系统，最大限度地筛查ROS1阳性患者，是ROS1阳性患者接受靶向药物治疗的关键。我国《ROS1阳性非小细胞肺癌诊断病理专家共识》 建议： 所有含有腺癌成分的晚期NSCLC 癌症患者在诊断时均应接受常规ROS1 融合基因检测。 ROS1 检测还应对小活检标本或非吸烟鳞状细胞癌患者进行。对于NMPA批准的药物，首选RT-PCR检测ROS1试剂盒，其次是经过验证的FISH检测平台。 ROS1 IHC 结果不能直接指导临床剂量。此外，ROS1 IHC检测结果呈阳性的患者应通过RT-PCR/FISH技术进一步确认[4]。

表1：ROS1融合基因各种检测方法比较[2]

参考：

[1] NSCLC指南NCCN 2022V1. [2] 蒋伟. ROS1融合基因突变在非小细胞肺癌诊治中的研究进展. 中国临床肿瘤学， 2019, 46(5):257-262. [ 3]]中华医学会病理分会等.非小细胞肺癌分子病理学检测临床实践指南(2021年版).中华病理杂志，2021,50(4):323-332.[4]肺癌，中国抗癌协会病理专家组，ROS1阳性非小细胞肺癌诊断与病理学专家共识[J]，中华病理杂志，2018（4）。[5]青，张杰. ROS1融合基因及检测技术在非小细胞肺癌中的应用进展[J]. 中华病理杂志，2017(10).[6] Bubendorf L, et al. Virchows Arch.2016 ;469 (5) :489-503.[7] http://www.amoydx.com/productDetail_26.html[8] Sholl LM, et al. Am J Surg Pathol. 2013 Sep;37(9):1441-9. [9] 中文临床肿瘤学会非小细胞肺癌专家委员会.二代测序技术在非小细胞肺癌临床应用中国专家共识(2020年版)[J].中华肺癌杂志，2020(9).[10]大壮，等. ROS1融合基因突变非小细胞肺癌的诊断进展及ROS1抑制剂的研究进展[J]. 中国现代医学， 2021(4).

本文首发：医疗保健行业稀有标的生态系统本文作者：lll 编辑：Sweet

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