攻克动脉粥样硬化，致人体动脉粥样硬化的真正危险因子
chanong
|动脉粥样硬化（AS）是最常见的心血管疾病之一，其形成受到多种因素的影响，其中与年龄相关的多种功能�**侵匾脑颍饪梢运凳且桓龆捞氐牟∫颉Ｋ孀湃嗣巧钏降奶岣吆蜕�**惯的改变，富含饱和脂肪酸的动物肝脏和各种高脂肪食物进入了人们的日常饮食，大大增加了低密度脂蛋白在血液中积累的概率不断增加。再加上血管的强度通常随着年龄的增长而减弱，动脉粥样硬化是我国老年人死亡的主要原因之一。
目前研究表明，AS的本质是血管损伤后的慢性炎症反应，而诱发的各种细胞因子、炎症介质和炎症细胞从而进一步加重AS的症状，形成恶性循环。例如，单核细胞被募集到血管内膜病变处，单核细胞进入内膜，被激活并分化形成巨噬细胞，摄取大量脂质后，形成泡沫细胞（泡沫细胞是含有大量脂质的巨噬细胞） ）。它是动脉硬化（可导致心脏病和脑梗塞）的原因之一，也是血管僵硬的基础（Immunity，2017）。为了克服AS，研究人员对其发病机制进行了详细的研究，但其免疫机制仍然很大程度上未知。此外，该领域的大多数研究依赖于动物模型，这些模型不能充分再现人类免疫环境并且缺乏自发的斑块破坏（Thrombosis and Hemostasis，2016）。
文章介绍
2019年10月7日，美国伊坎医学院Chiara Giannarelli团队发表了题为《人类动脉粥样硬化斑块的单细胞免疫景观》（编号《Nature Medicine》）的论文，构建了第一个关于硬化的研究。地图。这项研究主要证明了AS 患者的斑块中存在独特的CD4+ T 细胞亚群以及活化和分化的T 细胞群，并且与斑块脆弱性相关的巨噬细胞亚群表现出选择性激活表型。我发现它表明了这一点。此外，硬化斑块高度表达PD-1（程序性细胞死亡蛋白1），这会导致T 细胞在疲惫后重新编程。最后，作者提出，使用PD-1抑制剂可能会增加患有潜在心血管疾病的癌症患者患心血管疾病的风险。
研究思路
为了建立动脉粥样硬化病变的免疫微环境图谱，识别血液成分的变化，并研究与临床心血管事件（CV）相关的细胞异质性变化，作者采用了CyTOF 质谱流式技术（mass cytometry），能够整合单细胞蛋白质组和转录组通过RNA测序（scRNA-seq）和CITE-seq（转录组和表位测序的细胞索引）技术的数据，收集了46名接受颈动脉SYM的患者6个月内的斑块（症状：动脉同侧发生脑缺血事件） ，即最近发病，17 名患者）和膜切除术的动脉内ASYM（无症状：患者术前6 个月内无缺陷）对29 名患者（平均年龄72.9 8.7 岁）的血液和斑块样本进行了研究。有过出血事件的人（即最近没有生病的人）。
首先，作者对15 名患者（7 名SYM 患者和8 名ASYM 患者）进行了CyTOF 分析，发现斑块中的T 细胞与血液相比表现出显着的异质性。同时，我们发现SYM 斑块中T 细胞适应性免疫失调。因此，作者对其余31 名患者进行了更详细的分析，首先对患者斑块和血液中的T 细胞进行CyTOF 分析，然后进行CITE-seq、scRNA-seq，并结合CITE-seq 和scRNA-seq。细胞间相互作用分析在受试者的T 细胞和巨噬细胞中发现了与CV 事件相关的斑块特异性免疫变化（图）。
研究过程
研究结果
1 动脉粥样硬化患者斑块和血液的免疫表型分析
首先，为了研究血液和斑块之间免疫细胞的差异，作者对组织和患者之间共享的蛋白质进行了无偏聚类分析，发现CD4+ 和CD8+ T 细胞的数量与血液相比，在硬化斑块。 65）。斑块中特别丰富的免疫细胞包括巨噬细胞、CD8+效应记忆(EM) T 细胞、CD4+ EM T 细胞和CD4-CD8- T 细胞。血液中存在CD14+ 单核细胞、自然杀伤(NK) 细胞、浆细胞样树突状细胞(pDC)、B 细胞和CD4+CD8+ T 细胞（图3）。
图3 血液中硬化斑块与免疫细胞的分布比例
2 CyTOF分析揭示动脉粥样硬化患者T细胞亚群的多样性
为了进一步研究血液中T 细胞和硬化斑块之间的差异，作者对ASYM 和SYM 患者进行了CyTOF 分析，发现斑块中CD8+ T 细胞比血液中占优势，并发现存在多种高度异质性T 细胞亚群。 （图4a-d）。
图4 血液和斑块组织的CyTOF 分析中CD3+ T 细胞分布和亚群特征。
细胞亚群的相对频率分析显示，斑块中具有更多的CD8+T细胞和更少的CD4+T细胞（图4f），证实斑块中富集了更多的CD8+T细胞。无偏聚类将斑块分为四个亚群（图4d），并显示CD69（一种早期激活和组织驻留标记）高度表达（图4e）。其中三个是CD8+ 亚群（MC10、MC11 和MC20），一个是CD4+ 亚群(MC12)。 MC10 衍生的CD8+ T 细胞高表达CD103，仅在硬化斑块中检测到，与人类淋巴和非淋巴组织中报道的经典组织驻留记忆(TRM) T 细胞相对应。这首次证明这种细胞类型存在于人类动脉粥样硬化动脉壁中。
作者还发现，与血液相比，来自MC11、MC12 和MC20 亚群的T 细胞在硬化斑块中高度表达PD-1（T 细胞活化的负调节因子和T 细胞耗竭的标志物）。 （科学，2017）。我们发现，这些亚群可以同时进行重编程，以响应慢性斑块炎症引起的T 细胞耗竭。
3 CITE-seq分析揭示动脉粥样硬化患者斑块和血液中T细胞和巨噬细胞的功能差异
为了进一步说明斑块组织和血液中免疫分子机制和信号通路的重要差异，作者对斑块和血液中的T 细胞和巨噬细胞进行了CITE-seq 分析。与之前的CyTOF 结果一致，T 细胞占硬化斑块中免疫细胞的大部分，并且硬化斑块中的CD8 + T 细胞比血液中更丰富（图5c）。
基因表达分析表明，斑块T细胞表现出与T细胞激活、细胞毒性和T细胞耗竭相关的转录特征（图5d），信号通路主要富集在炎症、细胞增殖和生存通路中。这已经得到证实。相反，血液T 细胞表达通常抑制T 细胞功能的基因（图5e）。同时，作者在亚群分析中发现，血液中的大多数T细胞处于静止状态，但在斑块中它们表现出明显的激活状态，这表明斑块中T细胞的功能正在持续发挥作用。炎症反应逐渐消失。
图5 血液和斑块组织的CITE-seq分析中的细胞分布(a-c)和T细胞差异表达基因分析(d-e)
对斑块巨噬细胞的CITE-seq 分析确定了五个不同的亚群，表明巨噬细胞中也存在功能异质性。基因表达分析表明，亚群1、2 和3 与激活和促炎特性相关，亚群5 具有泡沫细胞转录特征（图6）。由此，作者认为免疫细胞功能�**荂V的病因，而T细胞和巨噬细胞在CV事件中发挥着重要作用。
图6 血液和斑块组织巨噬细胞差异表达基因分析。
4 scRNA-seq 分析剖析SYM 和ASYM 患者斑块中T 细胞和巨噬细胞功能的差异
为了进一步研究T 细胞和巨噬细胞功能�**隒V 事件之间的关系，作者对SYM 和ASYM 患者的斑块进行了scRNA-seq 分析。作者首先分析了CD4+ T 细胞，结果表明，来自ASYM 患者的CD4+ T 细胞表现出转录谱和细胞激活的信号通路（IFNG 通路、I 型IFN 信号传导）。此外，这些细胞特异性上调IL-1 和IL-6 信号通路（IL-1 充当许可信号，稳定细胞因子转录本并实现效应器功能，而IL-1 充当许可信号，稳定细胞因子转录本并启用效应器功能）功能，IL-6 促进T 细胞存活）。另一方面，SYM 会形成CD4+ T 细胞斑块。在此区块中，IL-1 和IL-6 信号通路未上调。 SYM斑块内的CD4+T细胞表现出与T细胞迁移（RhoGTPase）、激活（PDGFR-）和分化（Wnt35、IL-236）相关的独特信号通路（图7a，b）。同时，作者发现SYM中的CD8+ T细胞亚群表现出激活IFN和T细胞耗竭信号通路的特征（图7c）。由于T 细胞耗竭的特点是对慢性炎症反应的非特异性抵抗力逐渐丧失（Nature Reviews Immunology，2015），这表明这些活化的T 细胞能够增强T 细胞耗竭。这建议您开始编程。
图7 SYM和ASYM患者斑块中CD4+T(a-b)、CD8+T(c)和巨噬细胞(d)差异表达基因分析。红色代表SYM，蓝色代表ASYM
巨噬细胞的差异遗传分析表明，ASYM 巨噬细胞比SYM 巨噬细胞更活跃且促炎症。 SYM巨噬细胞通路分析包括参与斑块不稳定的促血管生成IL-8和CXCR2信号传导，而涉及Hedgehog和Wnt信号传导的抗纤维化通路可能与斑块不稳定相关（图7d）。
总之，作者结合单细胞蛋白质组学和转录组学，揭示了与心血管事件相关的斑块中新的免疫失调。 SYM 患者的两种T 细胞谱系都显示出与激活、分化和耗竭基本一致的基因表达特征，而ASYM 患者斑块中的大多数T 细胞都被激活。
5 动脉粥样硬化患者斑块中的细胞间相互作用
最后，作者分析了细胞间相互作用，以研究ASYM 和SYM 患者硬化斑块中T 细胞和巨噬细胞的独特功能状态。首先，研究了T 细胞之间的相互作用，发现ASYM 斑块内CD4+ 和CD8+ T 细胞之间的配体-受体相互作用表现出促炎表型，促进其激活（图8a）。在SYM斑块中，CD4+和CD8+T细胞均表达PSEN1（一种Notch受体，可以裂解斑块中表达的T细胞），该信号负责T细胞激活、分化、PD-1表达并可能有助于控制裂解功能。
T细胞-巨噬细胞相互作用可能导致SYM斑块内的T细胞通过表达结合TLR（VCAN）的配体激活巨噬细胞（TLR1/2）并导致斑块脆弱性。（主要是由于CCL5 - CCR5相互作用的结果）（图.8b).巨噬细胞-巨噬细胞相互作用表明，ASYM 斑块中的巨噬细胞可以通过自我招募和IL-1 信号传导诱导自我激活和促炎症相互作用，而SYM 斑块中受损的巨噬细胞无法诱导细胞迁移。炎症反应（图8c）。
图8 SYM 和ASYM 斑块之间差异表达的配体-受体相互作用。
结论与展望
这项研究结合了三种技术：CyTOF、CITE-seq 和scRNA-seq，创建了第一个人类动脉粥样硬化斑块的单细胞免疫图谱，并识别了与CV 事件相关的特定免疫失调。与此同时，作者确定了斑块T 细胞类型的异质性和相应的专门功能。与血液相比，斑块中的T细胞具有增强的激活、分化和耗竭能力。此外，硬化斑块内高度表达PD-1 的T 细胞被耗尽，这表明PD-1 抑制剂可能会激活斑块内的此类T 细胞。使用PD-1 抑制剂治疗CV 疾病患者可能会适得其反，因为斑块T 细胞的激活会加剧动脉粥样硬化。最后，作者得出的结论是，未来的心血管疾病监测应重点调查免疫抑制药物对心血管患者的副作用，这对于改进临床药物选择和心血管疾病监测有很大帮助。同时，这项研究也将为老年人常见疾病动脉粥样硬化的治疗提供新思路。
参考：
[1] Tabas I, Lichtman A H. 单核巨噬细胞和T细胞在动脉粥样硬化中的作用[J]. 免疫， 2017, 47(4):621-634.
[2] Heiden K V D, Hoogendoorn A, Daemen M J, et al. 斑块破裂动物模型： 生物力学评价[J], 血栓与止血， 2016, 115(03):501-508.
[3] Kamphorst, A. O. et al. PD-1靶向治疗对耗尽的CD8 T细胞的拯救是CD28依赖性的[J]. Science, 2017, 355:14231427.
[4] Wherry E J, Kurachi M. T 细胞耗竭的分子和细胞见解[J]. 自然评论免疫学， 2015, 15(8):486-499.