氮气等离子体怎么形成，等离子氮化层有多少

简介氮等离子体是指通过施加足够的能量，氮分子中的电子被激发或电离，形成高度电离的氮离子和自由电子的状态。

我们的研究表明，氮等离子体修饰的聚苯乙烯可以显着提高脐带间充质干细胞的粘附和增殖能力，并且这种修饰材料在细胞培养环境中促进干细胞与基质的粘附，发现可以提高干细胞的增殖率。

材料和方法使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)和水接触角测量对沉积表面进行实验表征。

我们还研究了等离子体处理的PS 表面对WJMSC 细胞行为的短期影响，包括7 天的粘附、增殖率和干性，并将其与市售的氧气预处理的PS 培养皿进行比较。

PS 样品的制备在本研究中，我们使用直径为35 mm 的PS 培养皿作为材料模型。小心地从每个培养皿底部切下一小块，得到直径为14毫米的圆形PS薄膜样品。我使用不锈钢刀片并将其连接到电动工具上。

在整个切割过程之前、期间和之后对样品薄膜进行了仔细处理，以防止指纹和其他表面损伤和污渍，并且切割后，将这些样品薄膜在乙醇中超声清洗5分钟，然后将其放入等离子室中并进行灭菌。

在实验中，这些样品薄膜被用作回收的PS材料（NH3处理的PS或N2处理的PS）与指定的等离子气体相互作用。

这些PS膜样品被随机分为两组，第一组接受为期30天的长期理化评估课程，第二组接受为期7天的短期理化评估课程以研究相互作用。 WJMSC。

等离子体处理为了处理回收的PS薄膜样品，使用了工作频率为13.56 MHz的自制电感耦合放电等离子体装置，将回收的PS薄膜样品引入腔室中并使用旋转泵加压。基础压力可达2.1Pa。

在处理之前，使用氩等离子体溅射进行10分钟的清洁，通过在表面上沉积惰性气体（例如氦或氩）和含氮气体（例如N2或NH3）的混合物来引入氮功能性。 PS胶片。

气体混合物的总压保持在13.33Pa的恒定值，N2和NH3与He或Ar的体积比固定在10%，并且以50W和100W的RF功率进行沉积工艺。持续时间为15 分钟。

评价接触角测量采用固滴法，液滴体积为10微升，用微量移液器将水滴滴到PS薄膜样品表面，采集并拍摄水滴图像，得到水滴图像。测量接触角并输入图像分析软件。

测量水接触角可以显示表面性质和化学性质之间的关系。接触角以度() 为单位测量，表示液体界面接触固体表面的角度。接触角越大，表面越疏水。

为了研究样品表面的化学键合，我们使用Nicolet 6700 FTIR 分光光度计的ATR 装置，在400 至4,000 cm^-1 范围内以4 cm^-1 的分辨率平均进行64 次扫描。收集光谱。

X射线光电子能谱使用单色Al-K- X射线源(h=1,486.6eV)，并使用UltraDLD能谱仪。

该分析方法通过将阳极电压设置为15 kV，电流设置为10 mA，可以定量和定性测定元素的表面成分。

测量光谱的能量通量为160eV，速率为1eV/步，面扫描的能量通量为40eV，速率为0.1eV/步，分析室压力维持在710^ 7帕。分析过程中，请参考“使用C1s中性碳峰的结合能为284.6eV”。

细胞行为研究将两种处理过的PS 膜类型与PS 对照组进行比较时，选择的主要标准是第一天的最高细胞粘附效率。

细胞培养并接种于含有20%（vol/vol）FBS（胎牛血清）（Gibco）、10ng/mlbFGF（碱性成纤维细胞生长因子）和5mg/ml牛胰岛素的DMEM中。 PS 培养瓶。

培养环境维持在37、5%CO2和95%相对湿度，每2天更换一次培养基，直至细胞群达到80%汇合。

从培养瓶中取出细胞后，将细胞置于含有0.05%（vol/vol）胰蛋白酶-EDTA的溶液中10分钟，消化后，收集细胞并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤并离心。

将细胞重悬于培养基中，计数，并将细胞密度调整至30,000个细胞/ml，接种到每个PS膜样品上，并沉积在24孔PS培养板的每个孔的底部。

PS膜样品直径与24孔培养板孔径匹配，接种后第1、3、5、7天观察细胞贴壁和增殖情况，重复实验5次。使用细胞密度、培养条件、重复次数和评估周期在PS 对照24 孔培养板上进行类似的操作。

细胞贴壁效率和增殖检测Vybrant MTT 细胞增殖检测试剂盒用于定量评估BCP-K1 细胞的贴壁效率和增殖检测。

将含有贴壁细胞的PS 膜样品转移到新的24 孔板中，并用500 l 新鲜培养基填充每个孔，以避免对从PS 膜样品溢出的细胞进行错误评估。首先在24 孔培养板中运行PS 对照细胞。检测。

每孔加入50 l MTT溶液（终浓度0.5 mg/ml），37孵育4 h，加入500 l增溶混合物（1 g SDS：0.1 MHCl）以去除活性细胞产生的甲酰胺晶体. 裂解并在37C 下孵育4 小时，然后在37C 下孵育过夜。

使用Spectra MR 微孔板分光光度计在570 nm 处测量每孔液体的比色光密度(OD)。将各PS膜样品在不同培养时期的OD570值与1天对照进行增殖测试分析比较。该值表示为附着和增殖的细胞的百分比，较高的细胞附着和增殖率对应于较高数量的活细胞。

FAK-ELISA 焦点粘附激酶(FAK) 使用酶联免疫吸附测定(ELISA) 来检测细胞内锚定依赖性蛋白对每个PS 膜样品的粘附。将细胞接种到PS 膜样品上后，对每个细胞进行FAK-ELISA 测试。分别在第一天、第三天、第五天和第七天进行。

对于每个样品，首先用PBS 洗涤2-3 次，用4% (v/v) 甲醛在室温下固定20 分钟，然后用洗涤缓冲液（PBS 中的0.1% (v/v) TritonX-100）固定2 清洗两次。在含有1% (v/v) H2O2 和0.1% (v/v) 叠氮化物的洗涤缓冲液中孵育30 分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤。

将含有5% (v/v) 牛血清白蛋白(BSA) 的封闭缓冲液添加到细胞中并孵育1 小时，然后添加抗fak 一抗(1:2000, Sigma) 并在4C 下孵育过夜。将辣根过氧化物酶(HRP) 偶联的二抗添加到每个样品中，并孵育2 小时。

将HRP 底物SIGMAFAST OPD（邻苯二胺二盐酸盐）加入样品中，避光孵育30 分钟，发生显色反应，使用上述微孔板分光光度计测定OD492nm 处样品的光密度。

免疫测定用于短期细胞行为研究，涉及对在PS 表面生长的三组BCP-K1 细胞进行免疫细胞化学处理。在实验开始（第1 天）和实验结束（第7 天）时，检查PS 膜的表面细胞。

步骤如下：用1x PBS (pH 7.4) 清洗PS 膜上的细胞，用含4% 甲醛的PBS 固定15 min，用PBS 清洗3 次，并在PBS 中加入0.1% TritonX-100 溶解并37C 孵育。在C 下孵育30 分钟，并在室温下继续孵育10 分钟。

室温下用PBS轻轻洗涤细胞3次，用10%牛血清白蛋白（BSA）封闭，将细胞置于加湿容器中室温1小时，4孵育过夜。将针对(1:2000)、CD34 (1:2000)、SSEA-4 (1:2000) 和CD9 (1:5000) 的单克隆抗体与细胞接触。

用PBS洗涤3次后，将以下山羊抗小鼠二抗添加到细胞中：AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG1（浓度1:200）、AlexaFluor594山羊抗小鼠IgG3（3）（浓度1:200）、和AlexaFluor 546 山羊抗小鼠IgG2b (2b)（浓度1:200）。

抗体在室温下避光孵育1小时，并用PBS再次洗涤细胞3次，并在含有300 nM 4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的溶液中孵育。

使用Extend Gold抗褪色试剂密封细胞，让染色的细胞在室温、黑暗中固化24小时，并使用微荧光显微镜拍摄固定细胞的照片。

使用配备数字显微镜成像装置的光学显微镜观察细胞形态，并使用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞表面附着机制的细节。

数据分析所有数据均以平均值标准差（SD）表示，采用单向方差分析分析各PS膜样品与对照组之间的平均差异，并多重邓肯校正（p0.01）。来进行比较。

等离子体处理聚苯乙烯的表面润湿性和老化效果在N2和NH3等离子体处理下，处理后的PS薄膜表面的亲水性显着提高，处理后样品的接触角显着降低至20（未处理）。治疗角度为20）。角度为82.8），可以看出水在材料表面扩散良好，材料表面的疏水性降低。

经过等离子体处理的含氮PS薄膜变得更加亲水，并且在等离子体处理过程中，更多的极性基团（氧化结构，如-NH2、羰基、羧基、酯基等）接枝到表面，非极性基团被接枝到表面。分子表示伦敦力，这是由于分子之间电子的相关运动而产生的弱力。

如果材料疏水性太强，细胞外基质（ECM）分子就会以变性、刚性的状态被吸附，但这很困难，因为细胞粘附受体（例如整合素）很难访问这些分子上的特定位点。附着于细胞。地点。

表面能的极性分量包括所有其他非伦敦力相互作用，例如偶极-偶极分子间力和氢键相互作用。在亲水表面，细胞对亲水物质的粘附力更强，粘附面积也更大。

ECM 蛋白以更灵活的形式吸附，允许细胞重构，并为细胞粘附受体提供进入这些分子上粘附位点的机会。

细胞行为当我们使用BCP-K1进行7天的细胞行为实验时，我们发现处理后的PS细胞与细胞膜的粘附力较对照组的PS细胞显着增加，尤其是混合HE组。显著地。

50W条件下，两个混合Ar组的细胞粘附程度较低（p0.01），在50WN2+He、100WNH3+Ar、100WNH3+He条件下培养3、5、7天时， BCP为-K1，具有在膜表面增殖、铺展的倾向。

与第1天相比，第7天对照组PS细胞的相对增殖率仅为80%，而经过处理的PS膜样品第7天的细胞增殖能力与第1天一样低。这是对大约150%。

我们选择50WN2+He和100WNH3+He等离子体处理作为PS表面的最佳处理，因为它们具有最好的细胞粘附和增殖效率。请注意，水接触角是在干燥表面条件下测量的。表面处理后立即进行。

在为期7天的实验中，将表面浸入培养基中产生“疏水性恢复”和“衰减效应”，最终导致细胞增殖，当天发现BCP-K1对NH3+He50或100W表面具有抗性1、表现出良好的附着力。但在第7天时表现出较弱的增殖能力。

细胞培养7天内官能团的泄漏可能是由培养基和培养条件引起的。这是由于“疏水性恢复”和“阻尼效应”。 Ar和He是辅助和维持等离子体状态的前体气体。本实验中未评估细胞行为，因为胺仅在经过处理的表面上产生。

结论采用含氮氨等离子体对PS薄膜样品进行表面改性，使薄膜表面沉积官能团，并采用N2+He或NH3+He考察PS表面胺官能团的稳定性。实现。这种处理为胺官能团提供了稳定的共价键合位点。

结果表明，细胞粘附和增殖能力显着提高，膜稳定性也显着提高。这不仅可以从PS表面官能团羰基、酰胺和胺基的形成看出，还可以从润湿性和表面功能化的变化看出。解释。

等离子体处理表面的稳定性是通过形成由含氮气体和氦气的混合物组成的交联聚合物来实现的，这些发现为培养容器表面的改性提供了指导。

参考文献：[1]巴克什，《来源于脐带和骨髓的人间充质干细胞的增殖和多谱系分化潜力的比较》

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