全谷物与健康，全谷类食物不一定是健康的

阅读文章前，请点击右上角“关注”，鼓励讨论和分享，关注每日优质内容。全谷物是健康饮食的重要组成部分，富含膳食纤维并含有多种生物活性成分。全谷物对健康有许多好处，包括降低患心脏病、中风、二型糖尿病和结直肠癌的风险，减少肥胖，减少炎症和延缓衰老。全谷物的健康益处已达成国际共识，最新版本《中国居民膳食指南（2022）》将全谷物和各种豆类的每日摄入量从50克增加至150克。此外，全谷物食品还存在质地粗糙、适口性差、稳定性差、不易储存等问题。研究证明，发酵显着增加了全谷物产品中生物活性物质的种类和含量，显着增强了功能活性，改善了全谷物产品的口感和风味。发酵技术在全谷物加工中具有巨大的应用潜力。

甜味发酵食品是以燕麦、青稞、糙米为主要原料制成的日本传统全麦发酵食品和特色饮料，历史悠久，深受人民喜爱。甜醅含有丰富的微生物资源，但对其微生物群的系统报道较少，亟待研究和阐明。甜发酵粮的研究整合了全麦食品、发酵技术和微生物资源，对全麦发酵食品的研发具有很好的借鉴作用。本文以我国典型地区的传统甜醅样品为研究对象，利用高通量扩增子测序技术对甜醅样品的微生物群进行研究，找出细菌的群落结构和分析信息。细菌之间的关系。甜酒醅的特点。本研究将为探索传统全麦发酵食品的微生物资源、提高甜发酵粮的品质以及工业化生产奠定理论基础，也将为其他发酵食品的微生物研究提供参考。

我国典型地区采集的甜醅样品有三类：HN：中国南方湖南衡阳家庭作坊，HZ：甘肃惠州家庭作坊，LD：北京兰州饭店。采用美国QIAGEN公司的QIAGEN DNeasymericon Food Kit提取甜醅全基因组；采用美国Bio Scientific公司的NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit构建16S扩增子文库。甜酒醅测定使用相应试剂盒：北京索乐宝生物技术有限公司。

NanoDrop2000 超痕量分光光度计：Thermo Scientific，美国，V2S02S 微涡流仪：IKA，德国，SynergvHT 酶标仪：BIOTEK，美国，ABI GeneAmp 9700 PCR 仪：ABI，美国，EPENDORF 5810R 台式高速冷冻离心机：德国EPPENDORF 公司.有限公司；HH-4数显恒温水箱：江苏圣兰仪器有限公司；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所。将每份甜醅均质混合，称重1 克。按照试剂盒中的说明提取甜发酵谷物的全基因组。每个甜发酵谷物被采样三次，并提取三个基因组作为三个生物复制品。采用NanoDrop2000检测甜发酵谷物DNA的浓度和纯度。检测基因组DNA的OD260 nm/OD280nm值在1.8至2.0之间。整个甜发酵谷物DNA 样本储存在80C 下以备后用。

引物799F (AACMGGATTAGATACCCKG) 和1193R (ACGTCATCCCCAC CTTCC) 用于PCR 扩增样品的细菌16S rRNA V5-V7 区域。扩增过程为32个循环，包括94预变性5 min、94变性30 s、53退火30 s、72延伸48 s、72延伸。放置8 分钟并储存在4C 下。 PCR 反应体系为20 L，含4 L 5 PCR Mix、1 L 引物799F（10 uM）、1 L 引物1193R（10 uM）、10 ng DNA 模板和ddH2O。每个甜醅样品重复3次。将同一样本的PCR产物混合、收集、1.8%琼脂糖凝胶电泳纯化，对PCR回收产物进行检测、定量、建库，并将细菌扩增子在上海明治生物医学科技有限公司进行测序。测序平台为美国Illumina公司的Miseq PE300。细菌扩增子的原始数据已提交至NCBI SRA数据库，序列号为PRJNA905189。

采用Fastp0.19.6软件对细菌扩增子原始序列进行质量控制，并采用FLASH1.2.11软件进行序列拼接。质量控制包括将窗口值设置为50 bp，过滤read tail质量值小于20的碱基，最小重叠长度为10 bp，以及根据重叠关系选择reads，其中涉及将成对的序列拼接起来。拼接序列重叠区域允许最大错配率为0.2，剔除不符合标准的序列，根据标记序列和引物区分不同样本，调整序列方向。标记序列错配值设置为0，最大引物错配值设置为2。通过UPARSE7.1软件进行操作分类单元（OTU）聚类，设置相似性为97%并去除嵌合序列。使用RDP classifier2.13 将每个序列与silva138 数据库进行比较，并进行物种分类注释。使用PICRUSt2 2.2.0 来预测细菌种类的功能，使用Lefse (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root tool_id=lefse_upload) 来预测甜发酵谷物样品中显着差异的影响。将会受到影响的类群。

本研究完成了甜醅样品多样性数据的测序与分析，共得到优化序列481,313条，包含181,512,717个碱基，平均序列长度为377 bp。物种注释结果显示，甜酒酿样品包含细菌界26个门、55个纲、119个目、193个科、314个属、417个种、504个操作分类单元（OTU）。甜醅样品的覆盖度值均大于0.999，证明测序覆盖度非常好，测序深度足够。选择Chao1 代表样本丰富度，Shannon 代表多样性，Simpsoneven 代表均匀度。甜发酵谷物样品的HN丰富度和多样性以及甜发酵谷物HZ均一性最高，而甜发酵谷物样品的LD丰富度、多样性和均匀度值最高，但会较低。

谷物甜发酵菌多样性指数表

样品编号

覆盖范围

丰富

多样性

制服

霍尼韦尔

0.999 50.000 1

306.93.5

2.970.06

0.0260.002

L.D.

0.999 90.000 1

58.71.6

0.380.02

0.0250.002

赫兹

0.999 80.000 2

60.41.4

1.310.03

0.0460.003

在细菌门水平上，甜醅样品中厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门4个门的丰度均大于1%。 ）。厚壁菌门含量最高（甜醅HN-55.4%、LD-96.3%、HZ-98.4%），变形菌次之，甜醅HN含量最高，HN为30.1%。另外，甜醅HN中放线菌含量为11.2。厚壁菌门和变形菌门广泛分布于各种发酵食品中，是发酵食品微生物群中的主要菌群。由于其强大且广泛的适应性，它们也是许多其他环境系统中的主要微生物群。

放线菌门的成员分布在土壤、海洋等环境中，可以与植物共存，在自然界的氮循环中发挥一定的作用，其中著名的链霉菌属和放线菌属细菌就是例子。甜醅样品中含有属水平的多种抗生素，其中魏斯氏菌属、乳杆菌属、葡萄球菌属、潘诺杆菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、醋杆菌属等15个属的丰度超过1%。其中，魏斯氏菌属的甜酒醅LD含量最高（93.3%），乳酸菌的甜酒醅HZ含量最高（86.3%），葡萄球菌属的甜酒醅HN含量最高（33.8%）。 %)、韦塞拉(12.8%)。三种甜醅样品共有33个OTU，主要属于乳杆菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属和片球菌属。

甜醅LD中不存在独特OTU，而甜醅HN中独特OTU数量最多，这与上述多样性指数的结果一致。在微生物群中，魏斯氏菌属、乳杆菌属和片球菌属都属于乳酸菌（LAB），在食品和饮料的发酵中发挥着重要作用。据报道，Pannonibacter 成员具有Cr(VI) 还原特性。据报道，本研究中的葡萄球菌用于豆瓣菜酿造、乳酸生产和苯酚分解，是产生传统锦州虾酱中所含蛋白酶的嗜盐细菌，结果证明是葡萄球菌。其在甜发酵谷物中的具体功能作用值得进一步研究。

OTU水平的主坐标分析（PCoA）表明，三种类型的甜发酵谷物样品细菌形成了独特的集群群落。甜醅样品的细菌群落差异特征值为PC1为46.36%，PC2为40.05%。使用ANOSIM分析或相似性分析，还证实了三种甜发酵谷物样品的细菌群落存在差异（P=0.001）。 ANOSIM分析是一种非参数检验，常用于检验组间差异是否显着大于组内差异，并确定分组是否有意义。本研究中使用的甜发酵谷物样品是从不同地区和来源收集的，表现出广泛的细菌多样性和菌落结构。

其算法强调统计显着性和生物相关性，可以识别不同丰度性状及其相关类别，并进行线性判别分析（LDA）以查找样本之间显着差异的类群。在我们研究的甜发酵谷物样品中，Lefse分析发现了与样品相关的指示剂或生物标志物类群，对于细菌标志物类群的筛选，以LDA值为4为标准，不同类群之间发现了显着差异。使用单向方差分析检验进行验证。甜发酵谷物样品的HN 丰度和多样性最高，细菌标记类群数量也最多。在属水平上，细菌的特征类群主要包括乳酸菌属、葡萄球菌属、潘诺杆菌属和芽孢杆菌属。这些特征性细菌类群也包含在甜醅的主要细菌组成群中，这使得我们将重点放在这些类群上。

含有乳酸、黄酮类、氨基酸、蛋白质、淀粉、游离脂肪酸和还原糖。 db-RDA相关分析表明，甜醅的细菌组成与甜醅的性状显着相关。采用Spearman相关分析，魏斯氏菌属与氨基酸含量、还原糖含量显着相关，乳杆菌属与蛋白质含量显着相关，葡萄球菌属、芽孢杆菌属、潘诺杆菌属与淀粉含量显着相关。目前，全谷物发酵研究报道，多种乳酸菌的发酵促进燕麦、糙米等的改性，改善口感风味和营养价值。作为日本传统的全麦发酵食品，甜醅的微生物群研究还很少，未来需要进一步加强微生物与其特性相关性的研究。该部分研究为研究细菌与甜醅理化特性的相关性以及后续甜醅特性的改进提供参考资料。

利用PICRUSt根据16S扩增子测序结果预测细菌功能，通过每个OTU对应的greengene id获取OTU对应的COG信息和KEGG Ortholog（KO）信息，并计算KO的丰度。 PICRUST可以获取三个层面的代谢途径信息。微生物群的COG功能主要集中于一般功能，如氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢等。在KEGG途径3级，细菌功能主要集中在代谢途径、次生代谢物生物合成、氨基酸降解、氨基酸合成、RNA降解、碳固定、三羧酸循环等。由于碳水化合物和蛋白质是谷物发酵原料的重要组成部分，不难理解微生物群落的功能与其代谢相关，多组学的结合成为可能。进一步研究和分析微生物群落的功能。

本研究对我国典型地区采集的发酵全麦甜醅样品进行了细菌菌群研究，调查了甜醅的细菌群落结构以及细菌和甜醅的特征。有关之间关系的信息研究结果表明，甜醅样品中有4个门的丰度超过1%，其中以厚壁菌门最为丰富。在属水平上，魏斯氏菌属、乳杆菌属和葡萄球菌属最常见。三种甜醅样品中细菌群落的组成结构不同，这应该与其来源不同、原料不同有关。 Lefse分析在每个甜发酵谷物样品中发现了生物标志物类群，包括乳酸菌、葡萄球菌等。 db-RDA相关性研究揭示了甜醅的细菌群落和甜醅的特性。

甜醅样品营养成分化学性质表

样本

乳酸LA/(g/L)

黄酮F/(mg/g)

氨基酸AA/(mg/g)

蛋白P/(mg/g)

淀粉S/(g/100g)

游离脂肪酸FA/(mol/L)

还原糖RS/(mg/g)

霍尼韦尔

38.50.2

4.60.3

26.50.5

161.60.5

51.20.2

221.50.5

225.20.2

L.D.

20.40.3

1.90.2

23.60.3

125.60.3

47.90.3

144.60.6

208.30.5

赫兹

32.50.2

3.70.2

24.20.3

168.40.3

45.60.6

197.50.7

214.30.6

（乳酸、类黄酮、氨基酸、蛋白质、淀粉、游离脂肪酸和还原糖含量）被发现显着相关。甜发酵粮菌主要参与氨基酸的转运和代谢以及碳水化合物的转运和代谢。下一步研究将深入结合多组学技术、宏转录组学、代谢组学等研究，探讨微生物在甜醅发酵过程中的功能作用。本研究为探索传统全麦发酵食品的微生物资源、提高甜发酵粮的品质以及工业化生产奠定了理论基础，也将为其他全麦发酵食品的微生物组研究提供参考。这就是结果。