western一抗和二抗的区别，western一抗和二抗浓度

由广州莱德蒙生物科技有限公司实验室一助理主编。

抗体分类：

根据重链恒定区的血清学类型，抗体可分为五类：IgM、IgG、IgA、IgD和IgE，重链分别为mu、gamma、alpha、delta和epsilon链。是。上述每一类根据重链结构的变化又可分为若干亚类；例如人IgG可分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链分为两种：kappa链和lambda链，但每种抗体只有一种轻链。

二抗

二抗是在另一个宿主中制备的可以与一抗或一抗片段结合的抗体，通常用酶或荧光素等标记进行标记。二抗的优点是可用于Western blotting（通过与特定抗体结合来识别蛋白质）、ELISA（将抗体或抗原与酶结合并标记以识别特定蛋白质，特别是相应的抗原）。或检测抗体）。免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原）、免疫细胞化学（用免疫学方法检测细胞的抗原成分）、流式细胞术（通过激光激发的荧光来检测不同类型的细胞）、免疫沉淀（通过抗原和抗体与相应抗原的特异性结合来分离细胞类型）。由于二抗对特定物种（例如小鼠）的所有抗体具有特异性，因此使用偶联二抗无需标记每个一抗，从而节省大量时间和成本。另外，多个二抗分子可以与一个一抗分子一起使用。同时组合时，信号显着增强，实验灵敏度提高。

如何选择二抗

根据一抗的种类和种类选择合适的二抗。广义上讲，是指发生特异性反应、特异性结合的抗体，但在免疫反应中往往需要选择不同的二抗进行检测。由于可以选择多种抗体来检测任何目标蛋白，并且后续检测的检测方案也不同，因此二抗的选择应根据一抗类型和后续检测方案的要求来考虑。一般来说，选择合适的二抗应考虑以下几个方面：

[一抗种子来源]

二抗必须与所用一抗属于同一物种。示例：如果您的一抗是小鼠来源的单克隆抗体，请选择抗小鼠二抗（山羊抗小鼠或兔抗小鼠）。 ）；如果一抗是用兔血清制备的兔源性多克隆抗体，则相应的二抗应该是抗兔二抗。即根据一抗的物种来源，选择针对该物种的相应二抗。

[一抗类别和亚型]

二抗必须与一抗的类别或亚类相匹配。单克隆抗体通常就是这种情况。由于多克隆抗体主要是IgG 免疫球蛋白，因此相应的二抗是抗IgG 抗体。单克隆抗体的类别和亚类通常会在产品说明书中列出，如果一抗是小鼠IgM，则相应的二抗应该是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗属于小鼠IgG 的特定亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3），几乎可以结合任何抗小鼠IgG，建议使用专门针对该亚类的二抗。选择。例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，则可以选择抗IgG1二抗，特别适合双标实验。如果一抗的类型/亚类未知，可以使用针对相应物种的IgG。

[二抗种子来源]

一般来说，二抗类型的差异并不一定与二抗的质量有关，并且在典型的实验中，山羊二抗和驴二抗之间没有显着差异。但在一些特殊的实验中，比如双标实验，如果一抗之一是山羊来源，另一个是小鼠来源，那么相应的二抗就必须分别是抗山羊和抗小鼠了。二抗不能选自山羊或小鼠来源。有相应的源自驴的二抗，非常适合双标记免疫学实验。

[二抗的偶联标记]

一般来说，与二抗结合的探针主要包括酶（辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP、PAP）、荧光基团（FITC、罗丹明、德克萨斯红、PE、罗丹明、dilight等），含有生物素。金颗粒。探针二抗的选择主要取决于具体的实验。对于蛋白质印迹和ELISA，最常用的二抗是酶联二抗，而对于细胞或组织标记实验（细胞免疫化学、组织免疫化学、流式细胞术），则使用荧光A 标记的二抗。也可以使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。如果您希望进一步放大检测信号，可以使用生物素/亲和素检测系统。一些荧光检测方案需要选择不同的荧光标记，金颗粒标记的二抗在免疫电镜中更常用。

【是否是吸附在血清上的二抗】

测试样品应为人来源的蛋白质，一抗应为小鼠来源的单克隆抗体，二抗应为抗小鼠来源的二抗，如果对实验的特异性要求较高、血清吸附抗小鼠二抗这是吸附人血清的二抗，排除了可能与人体组织产生非特异性反应的IgG（如IgG）。最大限度地减少非特异性结合。

抗体

您可以从多种抗体中进行选择来检测您感兴趣的靶蛋白，但要缩小抗体选择范围并选择合适的抗体，您应考虑以下因素： 分析测试应用的类型l 样品蛋白质的结构特性l 样品类型l 抗体宿主类型l 抗体标记和检测l

1. 分析测试应用类型

抗体说明书通常列出抗体已经过测试和验证的分析类型，例如WB IHC、ICC 和ELASA 分析。如果抗体的说明书没有提及其用途，这种类型的分析用途仅表明该抗体尚未通过该分析测试的验证，并且该抗体不适合该特定的分析测试。如果是这样，这将在抗体中注明指示。因为它不适合某些分析测试。

2. 样品蛋白的结构特征

了解样品蛋白质的结构特性将帮助您选择最合适的抗体。至少需要考虑两个因素。

待测样品蛋白的结构域：通过用各种免疫原免疫宿主来制备抗体。免疫原包括全长蛋白质、蛋白质片段、多肽、整个生物体（例如细菌）或细胞。如果要检测蛋白质片段、特殊同种型或全长蛋白质的特定区域，应选择用含有该片段结构域的免疫原制备的抗体。如果您想使用FACS流式细胞术检测活细胞中的表面蛋白，您应该选择含有表面蛋白胞外结构域的免疫制备抗体。 l 样品提取或处理过程：有些抗体需要对样品进行某些特殊处理。例如，许多抗体仅识别还原和变性的蛋白质样品，其中表位暴露并且不受二级和四级结构的阻碍。一些抗体仅识别处于天然折叠状态的蛋白质。选择免疫组化抗体时，有些抗体只识别未固定的冰冻组织，而另一些抗体则适用于不需要抗原修复和解交联步骤的甲醛固定石蜡包埋组织。关于抗体说明书。

3. 样品类型

抗体应选择同一物种或具有交叉反应性的抗体。抗体具有较高的氨基酸序列同源性，可能与不同物种的相同靶蛋白发生交叉反应。如果您的样本类型没有在抗体说明书中列出的交叉反应物种中列出，则此表并不意味着该抗体不适合检测该类型的蛋白质，并且该物种是它只是意味着它尚未经过测试并且已验证。交叉反应性必须通过序列比对来预测。使用NCBI BLAST 预测交叉反应性并比较不同物种蛋白质的同源性。

4. 一抗宿主物种的选择

一般来说，当结合使用偶联二抗和未偶联一抗时，一抗宿主动物种类的选择更为重要。对于免疫组织化学，请务必选择与您的样本不同物种的一抗。二抗和样品内源性免疫球蛋白之间的交叉反应。例如，检测小鼠样品蛋白时，不应选择小鼠或大鼠来源的一抗。最好选择兔源性一抗。其次，可以选择与检测分子（酶、荧光素、生物素等）缀合的抗兔IgG 作为二抗。如果您选择含有缀合物的一抗，则上述情况不适用。除免疫组化外，其他不含内源性免疫球蛋白样品的检测方法对抗体的宿主种类影响不大。不含IgG。细胞裂解物样品的蛋白质印迹检测。然而，含有血清的组织裂解物和组织培养上清液含有免疫球蛋白，还原变性样品含有IgG。在蛋白质印迹检测中，IgG 分子显示为50 kDa 和25 kDa 重链和轻链的组合。乐队。

吸附的二抗：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构。一种物种的抗体可以与其他物种发生交叉反应。一些二抗吸附到动物或人IgG 上以减少非特异性背景。例如，对于小鼠组织或细胞，选择经过小鼠血清或IgG吸附处理的二抗可以减少非特异性结合。然而，此类抗体识别的表位数量显着减少。

以下摘录丁向远同志的观点，供参考。

@frankcai 认为：一般来说，单克隆抗体更具特异性，污染物更少，而多克隆抗体通常需要考虑蛋白质裂解，因此它们通常更便宜，易于制造。我的建议是选择大公司、有信誉的品牌，仔细阅读说明书并比较自己的实验系统。

@boom，我认为：检测到的是蛋白质磷酸化，应该使用单克隆抗体。

@关灯：单克隆抗体显然是最好的，但似乎更贵，而且实际上现在很多人都使用多克隆抗体。我服用了很多抗生素，效果很好。考虑到价格，如果有能力就购买单克隆抗体。

@johnsonchau认为：CST是首选，效力高、特异性好、价格合理。 abcam最全面，价格最优惠，santa性价比更高，产品种类齐全。 millipore旗下的chemicon和upstate也很不错。我认为多克隆抗体更常见、更实用。

@yihui88117 认为：一般来说，单克隆抗体优于多克隆抗体。许多公司都有可供购买的抗体。国外抗体比国产抗体好！不过，乙肝和戊肝抗体，价格昂贵，所以我觉得没有必要从海外购买！

@acong8186认为：我做western blotting已经2年多了，用过多种抗体，包括各种国产抗体。一般来说，单克隆抗体产生相对干净的条带，而多克隆抗体比单克隆抗体更有可能产生非特异性条带。不建议使用多克隆抗体。如果考虑经济条件，我们建议使用ABCAM 最近收购的兔单克隆抗体公司的抗体。价格在2000日元左右，比较实惠，而且好用。特别不推荐使用Santa Cruz 抗体。无论是单克隆抗体还是多克隆抗体。磷酸抗体必须是单克隆抗体。 CST一开始是做磷酸化的，但现在其他公司的磷酸化抗体，比如兔单克隆抗体、abcam以及Invitrogen旗下的几家公司的磷酸化抗体也比较优越。这一切都取决于运气和选择。如果你选择了多克隆抗体，第一次没有结果就太浪费了，而且我认为用多克隆抗体测试浓度和条件所浪费的钱比直接购买单克隆抗体要少得多.更喜欢单克隆抗体。之前投诉过CST的磷酸化ERK抗体和NF-KB抗体，但是我调整更换了，没有任何问题。使用其他常见抗体作为内标抗体，但选择国产抗体更可靠。我们的肌动蛋白是来自中山金桥的，我觉得还是不错的。换句话说，不建议使用多克隆抗体作为Western抗体。单克隆抗体更好，因为Western抗体条件更成熟，更容易获得条带结果。对于免疫组织化学，选择Santa Cruz 多克隆抗体。当然非常有优势。抗体量大，染色膜很漂亮，颜色也深，强烈推荐。

@wp008推荐的一抗选择原则：

1、查阅国外关于抗体的专业文献，查看哪些公司生产的抗体比我们的前辈多，综合判断杂志的质量、照片结果等，作为参考。

2、如果找不到相关文献或者找到的文献信息不明，还可以通过Santa Cruz、CST、abcam、chemicalon、upstate、millipore等知名品牌公司进行检索。其中，磷酸化抗体是CST优先考虑的。

3.物种反应性的选择：相应的抗体适合检测小鼠、大鼠、人等动物物种的抗原。

4.范围选择：用于Western blotting、免疫组化IHC、免疫荧光IF、免疫沉淀IP等，也可用于石蜡切片IHC-P和冰冻切片。

5、单克隆抗体和多克隆抗体的选择：由一个克隆产生的特异性抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体可以特异性结合单个特定的抗原决定簇，就像导弹精确击中目标一样。另一方面，即使对于相同的抗原决定簇，体内的多个克隆也可以产生抗体，形成多个单克隆抗体的混合物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，单克隆抗体一般特异性较强，但亲和力较低，抗原检测灵敏度较低，而多克隆抗体特异性稍弱，但亲和力较高，灵敏度较高，但其特点是抗原检测灵敏度较低。到各个乐队。我**惯选择多克隆抗体，因为还有一些其他问题。

6.来源物种：小鼠、大鼠、人、山羊等。这取决于您的实验室有哪些二抗。

7、厂家选择：例如Santa Cruz公司的一抗一般为1ml（浓度200ug/ml），价格为1900-2100元，与其他知名公司相比性价比较高。抗体投诉率较高，但来自Abcam、Chemicaln等公司的CST一抗一般为100l（浓度为1mg/ml），价格在2000-4000元之间。

8. 可以选择国内生产、海外原包装、海外进口包装吗？我们组只需要来自Boster 和Biosen 等公司的肌动蛋白内部参考。如果一抗将被多个学生在一个研究小组中使用或较长时间使用，我们建议从国外购买原厂产品。我们建议某些班级的学生导入并重新打包。

如上所述选择抗体时，如果文献报道较多，只需选择论文中描述的抗体品牌的一抗和二抗通常没有问题。或者，如果您需要它进行实验，请花时间搜索它。关于可靠的抗体。正确的抗体实际上会给您事半功倍的结果。