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显微镜用折射自适应光学器件自适应光学器件的英文名称是Adaptive optics (AO)。 AO 是指一系列强大的图像校正技术，这些技术已被证明对各种生命科学显微镜技术都有好处。然而，传统的AO系统更加复杂和昂贵，阻碍了自适应光学（AO）在显微镜中的广泛应用。德国制造商Phaseform 开发了一种折射式、完全在线AO 系统，消除了许多复杂的设置并降低了成本。在本应用说明中，我们研究了折射AO 概念如何增强显微镜功能，并通过宽视场AO 荧光显微镜证明了这一点。图1: 油/水浸显微镜装置。自适应光学AO 在显微镜中的应用人们常说，从显微镜到相机再到望远镜，光学成像系统的好坏取决于其光学性能。也许确实如此，但好的图像还取决于好的中间介质，只有中间介质允许，才能获得好的图像质量。通常有两个影响现代显微镜性能的像差来源。一是被测样品与物镜之间的折射率不匹配，导致球面像差。其次，被测样品的形状和折射率的变化会引入取决于样品本身的复杂像差。对于单分子和深层组织成像来说，这种由像差引起的“挑战”变得更加严峻。如果不进行校正，所获取图像的对比度和清晰度将会降低[1-2]，并且显微镜将无法达到其理论分辨率。在过去的二十年中，在显微镜中使用自适应光学器件的广泛研究已经证明了其有效性。无论被检查的样品或样品架的类型如何，AO都可以校正像差并恢复显微镜的原始性能，从而放宽指数匹配标准并减少检查的样品制备时间。 AO 适用于几乎所有先进的显微镜技术，包括共焦、宽场、多光子，甚至超分辨率方法，如STED、SMS 和STORM。特别是对于深层组织成像显微镜（一种独特地允许在自然环境中检查细胞的显微镜），AO 在远低于被测样品表面的情况下保持最佳分辨率。自适应光学AO的商业化之路尽管自适应光学AO子系统在专业天文学应用中很受欢迎，但AO自适应光学技术在显微镜应用中的发展却很缓慢。其主要原因是与专业天文学相比，显微镜的成本较低，此外显微镜的尺寸通常要小得多，并且由基于折射原理的透镜组成。尽管如此，尖端显微镜领域已经产生了第一个商用的显微镜自适应AO 系统解决方案。它们用作显微镜扩展端口的附件。在内部，波前测量和校正是通过使光瞳平面穿过可变形镜(DM) 来执行的，变形镜在校正后将光线重新引导到显微镜的检测/成像路径中。然而，这些第一代产品需要仔细设置，不具有普遍兼容性，并且仍然相对笨重。图2: 传统的自适应光学显微镜使用可变形镜来弯曲光路。图3:Phaseform 开发完全在线的自适应光学系统与Phaseform 全折射AO 显微镜直接集成Phaseform 的愿景是让大多数显微镜用户都能使用自适应光学技术。我们相信，从反射波前调制到折射波前调制的技术过渡对于提供集成的、更紧凑的AO 解决方案和不受影响的性能是必要的。

因此，我们提出了一种专为显微镜设计的全新完全在线AO 系统（图3）。 Phaseform的AO显微镜是通过以下两种方式优化传统AO系统来实现的。 (A) 用折射DPP 变形镜替换变形镜。 (B) 省略波前传感器并使用像差估计算法。折射DPP变形镜—— Phase-Form相位调制变形镜，自适应AO显微镜的关键技术DPP（Deformable Phase Plate），如图4所示，是一种新型动态光学元件。它的名字来源于传统的可变形镜子，这是一种带有表面浮雕的透明材料薄片，用于校正先进显微镜应用中的固定像差。然而，与它们不同的是，DPP 的表面可以通过跨越整个孔径的63 个致动器阵列动态地塑造成任何形状[3]。因此，这是代替变形镜的折射镜。图4：折射式63 致动器相位调制可变形镜DPP，能够校正第7 径向Zernike 模式。显微镜用DPP相位调制变形镜的主要优点是：

透射式：可以插入任何光路，无需重新计算、重新成像或弯曲光路。

尺寸紧凑：作为超薄传输元件，DPP变形镜从系统角度来看已经节省了空间，但其占地面积小，使其特别适合集成，允许它们连续多次使用，也可以堆叠它们。

高效：其操作与偏振无关，并且衍射损耗有限。

多功能：自动校正一阶和二阶球面像差和散光对于显微镜应用特别有用。然而，更复杂的像差，例如深层组织成像中由不同折射率区域引起的像差，需要DPP（类似于DM）可以提供的更高阶校正。

动态：DPP 可以在高分辨率成像和显微镜设置中实时控制和操作。

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不使用波前传感器的称为SWE（无传感器波前估计）的估计方法对于预测和校正光学像差很重要。波前传感器（例如Shack-Hartmann 传感器和干涉仪）通常用于经典AO 系统中来测量动态像差。然而，波前传感器的使用增加了AO 系统的复杂性和成本，因此不是一个实用的解决方案。特别是对于显微镜应用，限制可能仅仅源于显微镜设置的限制或所研究样本的性质。 SWE 无传感器波前估计是传统AO 显微镜波前传感器的替代方案，具有缓慢且相对较小的像差动态。 SWE算法有两个一般要求： 1. 了解您的样品或成像目标，以制定有用的品质因数，例如图像清晰度和对比度。这是基于实际像差估计所必需的，这些像差估计是针对波前调制器的不同位置所采集的一系列图像进行定量优化的。 2. 为所使用的波前调制器提供可预测且稳健的控制方案。为了有效地实施SWE 方法，波前调制器必须以几种精确的相关配置排列。 PhaseformDPP的静电驱动原理和直观的控制算法特别适合此类任务[4-5]。 SWE估计方法的代价是计算量的增加和图像采集时间的牺牲。然而，SWE 显着降低了AO 系统的硬件复杂性（参见下面的案例）。此类方法的不同变化的优点已在许多高端显微镜模式中得到证明，例如共焦、双光子荧光、结构照明、光片、STED 和SMS [1-2]。案例研究：即插即用自适应光学显微镜DPP 的传输工作原理与SWE 相结合，实现即插即用的AO 系统。与传统的笼式镜头类似，DPP 可以插入显微镜光路，中断最小或无中断，并动态校正系统和样品引起的像差。图5 显示了Phaseform Delta 7 格式DPP 集成到商用显微镜（图5a 和5b）和定制显微镜（图5c 和5d）中的四个示例。例如，用于对生物样本深处进行成像的宽视场荧光显微镜和高端双光子显微镜。 SWE 和DPP 的传输特性使其能够轻松集成到折射在线系统中。图5: 商用和定制显微镜中基于DPP 的AO 系统示例。 (a) DPP 集成在市售显微镜的物镜和转塔之间。 (b) 使用连接到相机端口的中继光学器件将DPP 集成到商用显微镜的共轭光瞳平面中。 (c) 用于荧光宽视野成像的“世界上最小的AO显微镜”[5]。 (d) 将DPP 集成到定制双光子显微镜的照明路径中（与因斯布鲁克医科大学的Alexander Jesacher 教授合作）[10]。图6 显示了AO 在显微镜中的优势。我们讨论样品深处双光子成像的示例结果以及系统和样品引起的像差的波前无传感器校正。左栏(a) 显示深度大于150 m 的小鼠大脑切片的神经成像结果，未进行AO 校正和进行AO 校正（与因斯布鲁克医科大学Alexander Jesacher 教授团队合作）。 (b) 列显示了40 m 深度的球形样品的成像结果。实验是与Prospective Instruments（Stefanie Kiderlen 博士和Lukas Krainer 博士）合作使用安装在双光子显微镜(MPX-1040) 上的DPP 进行的。图6: 使用不带波前传感器AO 校正的DPP（MPX-1040，Prospective Instruments）的双光子显微镜，使用(a) 定制图像和(b) 各种样品的市售图像。结论Phaseform 相信折射波前调制器和像差估计算法的最新技术进步将彻底改变自适应光学显微镜。

我们设想未来自适应光学器件将成为所有自制和商用显微镜的默认配置，类似于天文学中发生的情况。这个未来可能比我们想象的更近。 公司简介 上海星珀科技有限公司是一家专业从事光电设备代理、技术开发、技术服务的设备供应商。我们与全球专业设备制造商紧密合作，在拉曼、全息、荧光、时间分辨、单光子、量子、显微成像、超分辨率、非线性成像等光学领域提供专业服务。设计、光学系统、激光雷达、SRS、瞬态吸收、纳米定位……产品类别包括激光器、广谱光源、SLED、荧光源、滤光片（包括红外和紫外滤光片）、光谱仪、相机、包含单光子。探测器、条纹相机、超连续谱、白光激光器、日盲滤光探测器、高光谱系统、SDK、TCSPC系统……欢迎联系我们咨询！