食品中三聚氰胺的来源，三聚氰胺是食用物质吗
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|三聚氰胺的学名是三氨基三嗪，又称三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰胺。作为重要的化工原料，主要用于生产塑料、粘合剂、阻燃剂等。每个三聚氰胺分子含有六个氮原子，由于其含氮量较高，被非法添加到饲料生产中，以增加饲料的非蛋白氮含量。 2007年，美国发生多起宠物中毒死亡事件，2008年，美国发生多起婴儿食用婴儿配方奶粉后被发现患有尿结石和三聚氰胺的事件。含有三聚氰胺。鸡蛋中的三聚氰胺是一种常见的化工原料，受到社会的广泛关注。本节为全面了解此类化合物提供参考信息，包括三聚氰胺的理化性质、代谢动力学、毒性、国家和国际限制要求以及残留检测。我们概述了三聚氰胺的样品前处理和仪器测量方法。和残留检测。 1理化性质三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，分子式为C3N6H6，相对分子量为126.15，分子中氮原子含量为66.6%，密度为1.573 g/cm3。三聚氰胺在室温下为白色单斜晶体，20时在水中的溶解度为31g/L，水沸腾时溶解度增至25g/L。微溶于乙醇，不溶于乙醚、苯、四氯化碳，溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。常压下熔点为354，迅速加热至300时升华。虽然通常很稳定，但它在高温下会分解，释放出氰化物。三聚氰胺的pKb为9.0，其水溶液呈微碱性（pH=8），与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等形成三聚氰胺盐。在中性或弱碱性条件下，与甲醛缩合，生成各种羟甲基三聚氰胺，但在弱酸性条件下（pH 5.56.5），与羟甲基衍生物发生缩聚反应，生成树脂产品。当用强酸或强碱水溶液水解时，胺基被羟基取代，生成三聚氰胺、三聚氰胺和氰尿酸。三聚氰胺及其代谢物的化学结构如图7-12所示。
2 代谢动力学2.1 动物体内的吸收和分布Mast 等人对Fischer344 只雄性大鼠的研究发现，大鼠单次口服0.38 mg 三聚氰胺后，血液、血浆和肝脏浓度相似；这表明给予了三聚氰胺给药后。一旦进入体内，它可以通过体液分布到全身。吴等人给成年大鼠注射10 mg/kg的三聚氰胺，考察其在体内的分布，发现三聚氰胺分布于大鼠的血浆、胰腺、膀胱、肾脏、肝脏和大脑中，且在大鼠体内的浓度身体发生了变化，被发现了。肾脏是最好的。在随后的研究中，给大鼠每日剂量为100毫克/公斤的三聚氰胺，给药14天后，三聚氰胺分布在膀胱、肾脏、胰腺和肝脏，其中膀胱中三聚氰胺浓度最高。事实证明。研究表明，三聚氰胺在动物体内的分布不同，具体取决于给药途径或方法。 2.2 在动物体内的代谢和排泄目前研究表明，三聚氰胺在体内的代谢是一种不活跃或不活跃的代谢，以原形或同系物的形式直接从尿液中排出。 Mast等人的一项研究指出，大鼠单次口服三聚氰胺后，三聚氰胺迅速被吸收，血浆三聚氰胺在60分钟内达到峰值，90%的三聚氰胺通过肾脏排出体外。三聚氰胺在大鼠血浆中的半衰期为24小时。 2.7小时后，少量三聚氰胺从大鼠呼出气（0.2%）和粪便（0.64%）中排出，血浆和肝脏之间的浓度差也随之减小。虽然较小，但肾脏和膀胱浓度均显着高于血浆浓度，其中膀胱浓度最高，表明三聚氰胺在Fischer 344雄性大鼠体内并未被代谢。 Baynes等人给5头断奶仔猪静脉注射三聚氰胺，剂量为6.13 mg/kg，结果三聚氰胺在断奶仔猪血浆中的半衰期为4.04小时，肾清除率为27 mL/min，表观分配体积为0.61L/kg。黄小燕等发现日粮中添加100 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg三聚氰胺的仔猪血浆中三聚氰胺的半衰期分别为6.53小时、6.02小时、6.51小时，我发现了这一点。 Wu等人对大鼠进行的一项研究发现，三聚氰胺的口服生物利用度为98.1%，单次口服100 mg/kg三聚氰胺后，96年后有63%的三聚氰胺重新释放到尿液中。小时。被检测到。这些研究表明，三聚氰胺一进入动物体内就通过肾脏排出体外。在哺乳动物中，尿液是三聚氰胺的主要排泄途径，但在蛋鸡中，三聚氰胺也从蛋中排出，尽管这因种类和种类而异。动物两个物种之间的三聚氰胺代谢存在显着差异。 2.3 动物产品中的残留及去除Yi等人报道，用5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或100mg剂量的三聚氰胺污染饲料喂养蛋鸡后，鸡蛋中含有三聚氰胺。沉积程度当添加一定量的三聚氰胺时，三聚氰胺没有累积效应，而是随着饲料污染程度的加快而呈现增加的趋势。 Wendy等发现，鱼类摄入299-471mg/(kgd)的三聚氰胺3天后，鲶鱼中的三聚氰胺含量为81-210mg/kg，鳟鱼中的三聚氰胺含量为34-80mg/kg，而三聚氰胺的含量则为34-80mg/kg。鲶鱼中的含量在34 至80 毫克/公斤之间。罗非鱼的含量范围为0.02至177毫克/公斤，鲑鱼体的含量范围为58至94毫克/公斤。 Bai等人d)连续喂食。当连续34天施用62.6 mg/(kg·d)和140.9 mg/(kg·d)三聚氰胺时，饲料中较高剂量的三聚氰胺与组织和鸡蛋中检测到的较高浓度的三聚氰胺相关。在所有测试的样品中，鸡蛋的三聚氰胺浓度最高，十二指肠的三聚氰胺浓度最低。
第10天停止添加三聚氰胺时，蛋鸡组织中三聚氰胺浓度降至2.5mg/kg，第7天鸡蛋中不再检出三聚氰胺，第20天也未检出三聚氰胺。没有。在您的组织内未检测到。 Shen等人研究了泌乳奶牛中不同剂量的三聚氰胺从饲料到牛奶的转移。在为期19 天的研究中，动物连续13 天饲喂剂量为0（对照组）、90 毫克/天、270 毫克/天和450 毫克/天。结果，第3天牛奶中三聚氰胺含量逐渐升高，停止添加后第4天，所有试验组均不再检出三聚氰胺，三聚氰胺从饲料到牛奶的转移率低于添加剂的影响。结果表明，它不受尽管剂量与产奶量有关，但呈线性相关。王伟研究了饲料中不同浓度的三聚氰胺在育肥猪的血液和身体组织中的保留和去除模式。检测结果表明，育肥猪摄入三聚氰胺对采食量、日增重或饲料转化率没有明显影响，并表明日粮中含有0.211000毫克/千克三聚氰胺，连续42天摄入后，体内三聚氰胺水平下降。组织分别为0.04 至5.61 g/g（肾）、0.03 至2.80 g/g（背部肌肉）、0.02 至2.58 g/g（肝脏）、0（未检测到）至2.56 g/g（脑）。 0.02 0.252g/g（心肌）、0.022.55g/g（十二指肠）；摄入含1000mg/kg三聚氰胺的饲料42天后，上述组织中三聚氰胺残留量均超过国际规定的限量标准超标为2.5mg/kg。当停止添加三聚氰胺5天后，育肥猪组织中残留的三聚氰胺量迅速降至限量标准值以下，但三聚氰胺在组织中残留的时间越长，去除就越困难。 3、有毒的三聚氰胺在胃的高酸性环境中水解，首先产生二酰胺氰尿酸，然后进一步水解产生氰尿酸，在肠道中被吸收到血液中到达体内，这会对身体造成危害。表现出一定程度的专注并产生影响。经济合作与发展组织的报告指出，三聚氰胺的LD50在小鼠中为4,550毫克/公斤（口服），在大鼠中为3,161毫克/公斤（口服），这表明只有高剂量的三聚氰胺才有毒。对动物有轻度毒性。尽管三聚氰胺毒性较低，但摄入一定量后会影响生物体，引起膀胱炎和尿路结石等症状。通过对三聚氰胺本身对大鼠影响的研究，美国FDA（2008）认为三聚氰胺的每日耐受摄入量（TDI）为0.63毫克/公斤。 3.1 对泌尿系统的影响目前，三聚氰胺生物效应的主要靶器官被认为是泌尿系统。在动物体内，三聚氰胺仅通过肾脏排泄，且其排泄速度很快，因此三聚氰胺毒性主要表现为肾毒性。在Clark 等人的一项绵羊研究中，连续四个星期每天给绵羊喂食10 克三聚氰胺，绵羊的采食量减少，出现少尿，死亡前血液尿素氮和肌酐浓度升高。对死亡动物的检查显示出血性膀胱炎和晶体沉积的症状在肾小管中。研究报告称，猪和鱼每天摄入400毫克/公斤的三聚氰胺后只能存活三天。 Xie等人对大鼠进行的一项研究中，三聚氰胺处理组大鼠的肾脏出现水肿，并发现体重比对照组有所增加，组织病理学检查显示，高剂量三聚氰胺远端肾小管虽然有肾小管大量扩张，少量出血，肾小球正常，结晶主要沉积于肾乳头集合管、肾间质，可见炎症。 2004年和2007年美国因食用三聚氰胺污染食物而死亡的16只狗和猫的临床症状和解剖结果也表明，三聚氰胺主要对泌尿系统造成损害，得到证实。
16只动物均出现尿毒症，同时在远端曲折肾小管和集合管内观察到明显的条纹状晶体，晶体呈浅绿色，大部分呈圆形，有的呈球形。 Lam 等人研究了三聚氰胺对人体泌尿系统的影响。结果显示，大部分结石位于肾盂，经超声测量，结石大小在2.5至18毫米之间。对于直径小于10毫米的结石儿童，肌酐每增加10微克/毫摩尔，尿中三聚氰胺浓度就会增加。结石直径增加1毫米，表明三聚氰胺暴露水平较高。表明结石越严重，肾结石大小越大，与尿三聚氰胺浓度呈正相关。关等人还发现，大多数三聚氰胺结石儿童没有明显的临床症状。少数结石患者有少尿、血尿、蛋白尿等非特异性症状。有些人有多发结石或尿道扩张。严重者出现弥漫性肾损害、肾衰竭和腹水。 Kobayashi等人研究了小鼠摄入三聚氰胺和三聚氰酸后肾脏晶体形成和肾功能衰竭发展的机制，发现单独使用三聚氰胺或低剂量三聚氰胺-三聚氰酸后，在小鼠的肾脏中没有发现晶体。摄入该药物的患者。然而，随着剂量的增加和时间的推移，混合物治疗组小鼠的远端肾小管和集合管中出现了晶体。这些结果表明，三聚氰胺单独不能诱导晶体形成或导致肾衰竭。然而，研究表明，当两者同时存在时，毒性会增加。 Puschner等人给动物（猫）施用不同剂量的三聚氰胺、三聚氰酸及其混合物，结果表明，三聚氰胺或三聚氰酸单独给药时，不会引起猫的肾功能�**Ｊ┯酶没旌衔锖�48小时后出现肾衰竭。 Dobson等人以SD大鼠为研究对象，发现单独使用氰尿酸对SD大鼠的肾功能没有影响。使用二酰胺和氰尿酰胺的混合物，我们证明两种或四种的混合物会导致SD 大鼠肾功能损伤和肾结石形成。三聚氰胺与类似物质结合，在肾小管内形成不溶性晶体，最终导致管腔阻塞和肾功能衰竭。 3.2 对血液生化指标的影响黄晓燕等发现仔猪日粮中添加三聚氰胺有降低丙氨酸转氨酶（GPT）和天冬氨酸草酸转氨酶（GOT）活性的倾向。 Wang等人对怀孕雌性大鼠的研究发现，三聚氰胺喂养对血液中GPT和GOT活性没有显着影响。王伟教授通过在育肥猪饲料中添加三聚氰胺的实验，测定了猪血液中谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶的活性，以及血肌酐和胱抑素C的含量。结果表明，饲料中添加高剂量三聚氰胺（1,000 mg/kg）对育肥猪第28天和第42天的血丙氨酸氨基转移酶和血肌酐显着升高（P>0.05）有影响。对血浆胱抑素C含量无影响。 3.3 对生殖和发育的影响研究表明，动物长期接触三聚氰胺可导致不育和胚胎毒性。张等人发现，三聚氰胺会增加精子变形的速度，并会导致DNA损伤。
Wang等人从第13天开始使用低剂量（40毫克/公斤）和高剂量（400毫克/公斤）研究了三聚氰胺穿过小鼠胎盘转运的潜力及其对胎儿和怀孕母亲的影响。我发现了这一点。 F334小鼠在妊娠第20天灌胃三聚氰胺时，低剂量组小鼠羊水中未检出三聚氰胺，而高剂量组血浆和胎儿三聚氰胺浓度极显着升高。研究表明，摄入的三聚氰胺会穿过胎盘，到达胎盘屏障。尽管对胎儿有剂量依赖性影响，但不同剂量的三聚氰胺不会影响母亲的体重或数量。在胎儿体重、胎儿和胎盘中均未发现结晶体体重或胎儿肾脏。 3.4 致癌性根据WHO IARC分类，三聚氰胺被列为第三类致癌物。也就是说，它是一种尚未被归类为对人类致癌的物质或混合物。三聚氰胺的致癌性仅在大鼠和小鼠中进行过研究。雄性大鼠摄入三聚氰胺后会患�**螂缀褪淠蚬芤菩邢赴凰淙蝗矍璋范源菩源笫竺挥兄掳┬裕岬贾乱菩邢赴琢龅姆⒄梗⑶胰矍璋芬驯恢っ鞫圆煌亩镉胁煌亩拘浴Ｐ坌源笫蟀螂字琢龅姆⒉÷视肽蚵方崾纬珊统中哟ジ呒亮咳矍璋犯叨认喙亍Ｐ坌源笫蟀螂装┑姆⑸朴隓NA损伤无关，可能是膀胱内上皮细胞增殖和晶体沉淀引起的。这些研究还表明，三聚氰胺在引起膀胱结石时具有致癌性。总之，三聚氰胺对生物体（包括人类和动物）具有毒性作用，主要损害泌尿系统。三聚氰胺和三聚氰酸单独施用于动物时毒性非常低。然而，当联合使用时，它们会产生显着的毒性作用，主要对泌尿系统造成损害，例如形成肾结石和膀胱结石，并增加肾衰竭和形成泌尿道肿瘤的风险。其毒性具有物种选择性，对猫和大鼠的肾毒性比对小鼠的肾毒性更大。而且，对雄性动物的毒性作用更为明显。 4 国内和国际限制要求2012年7月5日，负责制定食品安全标准的联合国CAC制定了牛奶中三聚氰胺限量新标准。不要超过0.15mg。美国、欧盟等国家和组织也制定了各类食品中三聚氰胺的最大残留限量标准（见表7-5）。一般来说，大多数国家将婴幼儿配方奶粉中三聚氰胺的限量标准定为1毫克/千克，其他乳制品中三聚氰胺的限量标准为2.5毫克/千克。 2008年9月13日，中国国家食品质量监督检验中心指出，三聚氰胺属于化学原料，不允许在食品中添加，10月8日，卫生部、工业和信息化部农业部、国家工商总局、国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，设定乳及乳制品中三聚氰胺暂行控制值，即限量值针对婴儿奶粉中的三聚氰胺。奶粉的含量为1mg/kg，超过1mg/kg的产品不能销售。液态奶（含原料奶）、奶粉及其他奶粉中三聚氰胺限量为2.5毫克/公斤，超过2.5毫克/公斤的产品不得销售。其他含奶量超过15%的食品中三聚氰胺限量为2.5毫克/公斤，超过2.5毫克/公斤的产品不得销售。
5.样品前处理技术牛奶、肉类、奶粉等动物源性食品样品富含蛋白质和脂肪，这对三聚氰胺残留物的检测造成重大�**虼诵枰捎醚非按砑际酢Ｍü崛 ⒋炕⑴ㄋ醯却砑际酰コ分械娜矍璋凡辛簦コ跋旒觳獾脑又食煞郑岣呒觳夥椒ǖ牧槊舳取Ｄ壳俺Ｓ玫脑ご砑际醢ㄈ芗凛腿〖际酢⒐滔噍腿〖际酢⒒史稚⒐滔噍腿〖际酢⒎肿佑〖＜际鹾兔庖咔缀筒阄龃炕际酢� 5.1 溶剂萃取技术溶剂萃取是20世纪发展起来的一种分离技术，其原理是利用溶质将不同性质的物质分散在互不相溶或部分互溶的两个液相之间，以达到分离或纯化的目的。目标物质，包括液体。 - 液体萃取（LLE）和加速溶剂萃取（ASE）具有选择性高、分离效果好、适应性广的特点。三聚氰胺是一种弱碱性化合物，在强酸或强碱环境下会发生水解。三聚氰胺提取可在中性、酸性或碱性条件下进行，但对于食品基质，更常用中性和酸性（pH3）条件下的提取。对于中性条件下的萃取，通常使用乙腈-水或甲醇-水的混合物作为萃取剂。对于酸性条件下的萃取，可以使用各种溶剂及其混合物，包括三氯乙酸、甲酸、乙酸、盐酸和三氟乙酸，但最常用的是三氯乙酸。受三聚氰胺污染的样品一般富含脂肪和蛋白质，因此提取前必须进行脱脂和蛋白质沉淀。可以先用正己烷和二氯甲烷溶液脱脂，然后用三氯乙酸沉淀蛋白质，最后用乙腈沉淀蛋白质。提取三聚氰胺。但对于三聚氰胺和三聚氰酸的同时检测，目前，为了避免三聚氰胺和三聚氰酸的氨基和羟基发生聚合反应，形成不溶性水合物，一般对原料奶中的三聚氰胺及其有关物质进行测定。使用以下方法。对于酸性或碱性溶液条件，混合萃取剂由水相和乙腈组成，水相主要有三氯乙酸溶液、醋酸铅溶液、二乙胺溶液等。乙腈具有一定的蛋白质沉淀作用，可以去除样品中的部分蛋白质，但如果乙腈含量过高，三聚氰酸和三聚氰胺很容易形成网状聚合物并沉淀，降低萃取效果，最终影响萃取效果。提取。回收率及稳定性。朱丛英等人做了实验，比较了20%二乙胺-乙腈、2%三氯乙酸-乙腈、2.2%醋酸铅-乙腈、乙腈水溶液的提取效果。结果表明，在酸性或碱性条件下都有良好的回收率，其中用醋酸铅沉淀蛋白质效果最好。通过提取液配比优化试验，选择体积比为1:1的20%二乙胺-乙腈溶液作为提取液，加入1 mL饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白质。 5.2 固相萃取（SPE）技术SPE是应用液相色谱分离机理，利用固体吸附剂萃取原理，提取目标物质的样品纯化技术。吸附保留在柱内，用选择性溶剂除去杂质后，用洗脱液洗脱或加热解吸，达到分离浓缩目标化合物的目的。由于三聚氰胺是一种弱碱性化合物，在酸性溶液中会电解成阳离子，因此阳离子交换SPE柱（如强阳离子交换、混合模式阳离子交换和聚苯乙烯阳离子交换）通常可以去除阳离子。用于样品纯化以去除酸性干扰。目前，SPE柱最广泛用于选择性提取和浓缩各种基质中的三聚氰胺，例如SCX-C18混合装反相色谱柱、Waters Oasis MCX柱和Strata-X-C柱。
蔡勤仁及其同事建立了一种检测猪组织中三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰胺、二氰尿酸盐和环美辛的LC-MS/MS方法。对比MCXSPE柱和石墨化炭黑柱的净化效果，Sepucol石墨化炭黑柱对五种三聚氰胺化合物的回收率均满足要求。酰二酰胺的回收率最高，但三聚氰酸或三聚氰酸酰胺的保留很少。洗涤液和洗脱液的类型和使用顺序也会影响三聚氰胺的检测。理论上，为了纯化三聚氰胺，样品应该用酸性水溶液洗涤，然后用甲醇洗脱，因为酸性条件促进阳离子基团与三聚氰胺的结合。尽管SPE具有高效、快速、简单、溶剂消耗低等优点，但在处理大量样品时仍然是一项耗时且费力的任务。在实际应用中，SPE通常使用其他分析技术（例如SPE-HPLC、SPE-LC-MS和SPE-LC-MS/MS）自动在线操作。 5.3 基质分散固相萃取技术基质分散固相萃取是Anastassiades等人提出的一种快速预处理方法，省去了氮吹过程，一步完成样品提取纯化即可。传统SPE 方法中由于溶解、溶解、转移、乳化和浓缩而导致测试组分损失。与传统的残留检测方法相比，该纯化方法具有回收率高、稳定、简单、快速、经济、环保等优点。杨玉秀等利用DSPE纯化方法，更有效地去除了脂肪和蛋白质含量高的海鲜、复杂成分、色素、糖类、有机酸、石墨化碳等样品中的杂质，并对黑色、中性氧化3种纯化进行了比较。材料：铝和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)。结果表明，石墨化炭黑能有效去除杂质，但对三聚氰胺有较强的吸附作用，不适合水产品中三聚氰胺的净化；中性氧化铝粒径小，PSA比表面积小，吸附力大，比表面积大，吸附力强，对产品中的蛋白质、脂肪有良好的吸附性能，能有效去除干扰成分；PSA含有伯胺基和仲胺基，具有弱负电性；具有离子交换能力，有效去除干扰成分；对抗有机酸、色素、糖等。海洋产品，滞留效果极佳。通过实验，选择100 mg中性氧化铝和50 mg PSA净化效果较好。 5.4 分子印迹技术（MIT） MIT是一种利用具有分子识别功能的分子印迹聚合物（MIPs）的识别技术，具有与抗体一样的高选择性、高特异性、灵活性等优点，适合用作SPE 。利用填料或分子印迹膜对目标化合物进行分离和浓缩，以达到样品分离纯化的目的。迄今为止，使用MIP作为固相吸附剂特异性提取三聚氰胺的研究相对较少。 Li等人以环丙基三氨基三嗪为模板分子，甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯和乙腈作为功能单体、交联剂和致孔剂，制备了特异性识别三聚氰胺的MIP。该聚合物对三聚氰胺的最大结合浓度为53.2 mmol/mg，将其作为SPE吸附剂提取样品中的三聚氰胺，建立了牛奶和饲料中三聚氰胺的MIT-GC-MS分析方法。检测限为0.01。 g/g，定量限为0.05/g，样品加标回收率为93.1%至101.3%。牛继伟等以三聚氰胺为模板分子，采用沉淀聚合的方法制备了选择性高、吸附能力强的三聚氰胺MIP，将其作为SPE吸附剂，结合HPLC检测奶粉中残留的微量三聚氰胺。样品被检测到。
结果，提取回收率为85.1%~99.7%，SPE工艺避免了复杂的样品浓缩过程，缩短了样品前处理时间，减少了二次污染，使得大样品的直接纯化和浓缩得以实现。提取，降低了整体检测方法的检测限。何利民等人以环丙嗪为虚拟模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用本体聚合方法合成了具有优异三聚氰胺识别能力的MIP。该方法可有效分离、纯化和浓缩鸡蛋中的三聚氰胺，并与GC-MS技术结合对鸡蛋中的三聚氰胺进行定量，该方法的检出限为10 g/kg，平均响应率为82.8%。 5.5 免疫亲和层析（IAC） IAC的原理是将特异性抗体固定在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等固相支持物上，置于柱上，在抗原和抗体之间通过，即可实现完美结合。可同时分离纯化样品中的目标物质，并可浓缩样品中的目标物质，从而提高检测灵敏度，选择性好，操作简便快捷，耗时少，试剂用量少。具有省钱的优点。这是一种重要的预处理方法。钟等人研制了三聚氰胺IAC柱，用于提取和纯化受污染食品中的三聚氰胺残留物，该柱对三聚氰胺的最大结合容量为1250ng，加标回收率为82.5%101.4%。超过10.6%，可重复使用达30次，可直接提取家禽、鸡蛋和乳制品中的三聚氰胺残留物，无需样品预处理。 6 检测方法目前，国内外检测食品中三聚氰胺的方法主要为HPLC、LC-MS、GC-MS等色谱分析方法以及毛细管电泳（CE）、免疫分析、分子印迹技术等。接下来。近红外吸收检测法、荧光分析法等。 6.1 色谱分析方法色谱分析方法是目前应用最广泛的检测方法，具有快速、分离效果好、剂量低、无样品限制等特点，尤其对高沸点、大分子、强物质适用。分析极性、热稳定性和稳定性差的化合物。关于用色谱法测定三聚氰胺的报道很多。三聚氰胺的色谱分析检测方法主要有GC、LC、GC-MS、LC-MS等。目前，我国国家标准规定的生鲜乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法有HPLC、HPLC-MS/MS和GC-MS。该方法在生鲜乳及乳制品中的定量限为2mg/kg。 6.1.1 高效液相色谱法高效液相色谱法是目前食品中三聚氰胺检测最常用的方法，国内外已有较多报道（表7-6）。当三聚氰胺标准品在200500 nm波长范围内扫描时，发现三聚氰胺在236.3 nm处有最大吸收，样品中的三聚氰胺也在237.4 nm处呈现出最大吸收（图7-13） ）。我们发现，大多数报道都将240nm作为三聚氰胺的检测波长。由于三聚氰胺的紫外吸收光谱低于250 nm，如果样品制备和色谱条件不优化，很可能出现假阳性结果。为了提高结果的灵敏度和可靠性，经常使用DAD系统和荧光反应。结合起来检测样品中的三聚氰胺残留量。根据三聚氰胺的化学性质，通常使用两种类型的色谱柱进行分离。一种是C18和C8柱。三聚氰胺是一种高极性化合物，传统的反相色谱没有保留能力。为了获得分离效果，必须在流动相中加入离子对试剂，使三聚氰胺中生成弱极性物质。常用缓冲液和乙腈。作为流动相。文献中描述的流动相大多采用柠檬酸作为缓冲剂，庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、己烷磺酸钠作为离子对试剂，以及按特定比例混合的乙腈。另一种是阳离子交换色谱LC-SCX柱或IonPac CS柱。
该方法常采用磷酸盐缓冲液作为流动相，在240 nm的紫外波长下进行检测，样品回收率、相对标准偏差和重现性较好。但磷酸盐缓冲液是一种优良的细菌培养基，在使用过程中溶液会变得浑浊，菌落沉降，所以用醋酸铵或毒性相对较小的甲醇代替磷酸盐缓冲液，也有人用它作为固定相。
6.1.2 LG-MS LG-MS 的样品制备与HPLC 几乎相同，但使用MS 作为检测器在灵敏度和抗干扰性方面提供了一些改进，从而提高了灵敏度和重现性。由于检测限低，既可定性又可定量，因此准确度高，误报率低。目前，LC-MS和LC-MS/MS是三聚氰胺定性检测最重要的方法，国内外有很多相关的研究报道。 Andersen 等人报道了鱼、虾和其他动物产品中三聚氰胺和三聚氰酸的LC-MS/MS 检测。方法为酸性乙腈萃取，二氯甲烷脱脂，混合阳离子交换SPE柱浓缩/浓度，同位素稀释法定量。平均回收率为63.8%，相对标准偏差为21.5%。建立了LC-MS/MS方法检测羔羊肝、肾组织和血清中的三聚氰胺和三聚氰酸残留。结果表明，羔羊组织中三聚氰胺和三聚氰酸的检出限分别为10 ng/g和20 ng/g，血清中三聚氰胺和三聚氰酸的检出限分别为30 ng/mL和40 ng/mL。赵玉娟等报道了检测饲料中三聚氰胺的LC-MS/MS方法。料液用10 g/L三氯乙酸溶液提取，22 g/L醋酸铅溶液沉淀蛋白质，混合阳离子交换柱纯化，离心，0.45 m滤膜过滤，LC-分析MS/MS。分析和测量。三聚氰胺母离子126.9m/z、子离子67.5m/z 和84.6m/z 来鉴定和定量分析物。加标饲料样品的回收率为84.5%，检出限为0.01 g/L，相对标准偏差为6.5%。黄友胜等建立了快速测定鸡蛋中三聚氰胺残留量的HPLC-MS/MS方法。采用正离子扫描方式
（ESI＋）进行分析，以母离子126.9m/z、子离子67.9m/z和84.8m/z定性和定量待测物（图7-14）。该法检测限可达3μg/kg，定量限为10μg/kg，添加样品回收率为87.0%~96.8%。 但是由于三聚氰胺及其同系物为强极性的小分子化合物，在C18键合相色谱柱中几乎无保留。常通过添加离子对试剂，形成反相离子对色谱来解决这一问题，但添加高离子强度的缓冲盐和非挥发性的离子对试剂，不适用电喷雾离子源分析，且反相离子对色谱难以在一次运行中同时分离酸性和碱性物质。测定三聚氰胺常用磺酸基与C18混合填料色谱柱，这种填料色谱柱利用了阳离子交换与反相保留的机理，增加了碱性化合物与极性化合物的保留，它对三聚氰胺类阳离子化合物有很强的保留，但对三聚氰酸则不能保留。对于极性化合物而言，理想的解决方案是采用亲水作用色谱（HILIC）。HILIC机理是极性的待测物在相对非极性的流动相和极性的固定相之间进行分配。在HILIC中，水被吸附在固定相的表面，主要依靠分配作用分离，而非吸附作用。Andersen等用HILIC柱进行LC-MS/MS分析，可对鱼和虾组织中三聚氰胺残留进行定性和定量分析，其检测限为3.2μg/kg。Heller等建立了HILIC/LC-MS/MS法同时检测动物饲料中的三聚氰胺和三聚氰酸。将两性离子对添加到HILIC柱中，在pH梯度变化时可很好地将三聚氰胺和三聚氰酸分离，最低检测限为0.5μg/g。此外，利用LC-MS对三聚氰胺及其同系物的多残留检测也有报道。何君等建立同时检测大鼠血浆和组织中三聚氰胺和三聚氰酸含量的方法。在选择色谱条件时，在流动相中加入离子对试剂，采用体积比为9∶1的乙腈水溶液，并混有5mmol/L的乙酸铵和0.1%乙酸的流动相，以改善其在反相柱上的保留行为，同时加入甲酸提高离子化效率，使得三聚氰胺在色谱柱上能够较好保留；MS条件采用ESI离子源、SIM模式，并采用按运行时间段切换正、负离子模式，三聚氰胺采用正离子模式，三聚氰酸采用负离子模式，得到了较好的色谱峰和较高的灵敏度。简龙海等为避免使用ESI源产生基质抑制效应而导致灵敏度差的问题，采用APCI源同时进行尿液中三聚氰胺和三聚氰酸的测定，基质抑制效应可明显改善，三聚氰酸和三聚氰胺的灵敏度明显增强。蔡勤仁等建立了猪组织中三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺及环丙氨嗪的LC-MS/MS检测方法。进行了色谱条件选择和MS条件优化试验，结果表明，Waters Atlantis HILIC柱分离效果最好，并通过洗脱梯度的调节，将正负两组离子分开，采用正负离子切换的扫描方式（表7-7），灵敏度和峰形良好，方法检出限为2μg/kg，回收率为94.2%~99.9%，相对标准偏差为3.8%~7.5%。 6.1.3 GC-MSGC-MS也常用来定量检测和确证三聚氰胺及其类似物。由于三聚氰胺及其类似物均是沸点较高的极性化合物，且均含有—OH、—NH2等极性官能团结构，难汽化，直接采用LC进行分离较为困难，不但灵敏度低且峰拖尾严重。为改善各组分LC性质，在进行仪器检测前必须对样品进行衍生化处理。1987年，Toth等首先报道用GC-MS法来检测环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺。Zhu等也采用GC-MS法同时定量和确证动物源性食品中环丙氨嗪和三聚氰胺残留。样品制备时首先用酸性的乙腈或水溶液提取，然后将鸡肉或鱼肉用二氯甲烷脱脂，鸡蛋或牛奶样本用3%三氯乙酸萃取，而后提取物经MCX柱纯化，进样前用N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺衍生。肌肉组织中检测限为10μg/kg，牛奶和鸡蛋中检测限为5μg/kg。王征采用N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺衍生化，极性的减弱使其容易汽化，有利于待测物和基质的分离，降低了背景化学噪声的影响。王立媛等用GC-MS法检测奶粉和鲜奶中三聚氰胺，加标回收率为82.3%~110.0%，相对标准偏差小于10%，方法净化效果好、准确度高、灵敏度好、重现性高。吕燕等建立了鸡蛋中三聚氰胺残留检测的GC-MS方法。采用三氯乙酸、乙酸铅混合溶液提取鸡蛋中三聚氰胺，经混合型阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX，60mg/3mL）净化后衍生，生成稳定的衍生物后用GC-MS仪检测。方法灵敏度高，最低检测限为5μg/kg，回收率为72.31%~99.87%，相对标准偏差不大于11%。但是GC-MS法需要进行衍生化，样品处理步骤复杂、过程不易控制，不适用于多杂质生物检材中三聚氰胺的快速筛查和定量分析，不能满足快速大批量检测的需要。针对此问题，李东刚等利用离子阱GC-MS仪，建立了非衍生化-GC-MS/MS直接分析饲料中三聚氰胺的方法。利用三聚氰胺的二级质谱进行定性，以二级质谱的特征离子峰m/z 85进行定量，方法的精密度为5.9%，回收率为87%~98%，可满足饲料中三聚氰胺检测的限量要求。朱聪英等建立了用GC-MS同时检测三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的方法。为改善各组分GC性质，样品经BSTFA衍生化后，所含氨基、羟基上的氢均可被三甲基硅烷（TMS）所取代，形成含有3个硅烷基结构的衍生物（Tri-TMS），此时的色谱行为良好。衍生化后的4种化合物的质谱图见图7-15。三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺衍生物的特征离子分别是（m/z 342、327、171、285）、（m/z 345、330、100、147）、（m/z 344、329、171、100）和（m/z 343、328、171、285），其定量离子分别是m/z 327、345、344、343。6.2 CECE又称为高效毛细管电泳（HPCE），是一种以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分间电荷大小和亲水性的差异而实现分离的技术。CE具有样品用量少、分析成本低、分离效率高和基质干扰程度低等优点，被广泛用于各个领域，用HPCE分析三聚氰胺的研究已有不少报道。 与HPLC法相比，HPCE法兼有电泳和色谱双重技术的特点。HPCE分离效率比HPLC法高，且分离迅速，经相同前处理后，HPCE法比HPLC法对三聚氰胺的分离效果更好；HPCE法样品消耗量比HPLC少；HPCE比HPLC经济环保，HPLC使用的色谱柱价格是毛细管柱价格的几倍。此外，HPLC分析一个样品时，时间越长消耗流动相越多，不仅价格昂贵，而且给环境造成严重的危害。而用HPCE检测一个样品只需1mL缓冲溶液，价廉易得，对环境几乎无污染。但是由于HPCE进样量少、毛细管柱内径小、光程短（CE检测窗口仅为液相检测池的1/20），它的灵敏度受到严重限制，且稳定性也有待提高，所以常规CE检测痕量三聚氰胺还有一定的局限性，只能用于含量较高的样品分析。饶钦雄等利用CE检测鸡蛋中三聚氰胺分离时间约6min，测得的定量限为0.25mg/kg。为了提高检测灵敏度，常将CE与UVD、DAD等联合进行食品中三聚氰胺残留的痕量检测。Cernova等采用CE-UCD对奶粉中的三聚氰胺进行快速检测，其检测限可达到0.06μg/mL。Yan等提出用CE-DAD检测奶制品、鱼饲料和鱼肉等多种样品中的三聚氰胺残留。Chen等运用CE也建立了一种可同时检测牛奶中三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的灵敏、简单和可靠的分析方法。该方法将CE和DAD联用，在检测系统中添加十二烷基磺酸钠作为筛选介质以增加分离效率。结果表明，根据迁移时间和紫外吸收光谱的不同可实现三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的同时检测，其检测限分别为0.047μg/mL和0.067μg/mL，与HPLC法相比具有分辨率高、分析时间短、所需样品量少、分离效率好等优点。Xia等将毛细管区带电泳（CEZ）法联合二极管陈列检测器（CZE-DAD）建立了一种简单、快速、准确并可同时检测鸡蛋、宠物饲料和奶制品中的三聚氰胺及其类似物的方法。有报道，与HPLC、荧光光度法和常规的CZE等方法相比，场放大进样-曲带毛细管电泳（FESI-CZE）具有以下明显优势：①灵敏度高。利用在线富集技术可使灵敏度提高近3个数量级，弥补了CE-UVD在测量灵敏度上的缺陷。②抗干扰能力强。在电渗流被抑制的情况下采用电进样方法，对进入毛细管中的成分具有选择性，进样时样品通过电泳作用力引入毛细管中，在正向进样电压下，仅阳离子化合物能进入毛细管中，而基质中一些中性分子或阴离子化合物不能进入或只能少量进入毛细管中，从而克服了样品中存在的部分干扰。③运行成本低，经济环保。利用FESI-CZE技术的优势，李娟等建立了基于水塞联用FESI的CZE检测多种样品中三聚氰胺的分析方法。试验条件：水塞组成为40%乙腈和60%水，水塞进入时间200s，进水压力3kPa。以120mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-10%甲醇为运行缓冲溶液，以0.10mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-20%乙腈为样品基体溶液，进样电压20kV，进样时间80s，分离电压20kV。通过在水塞后电动大体积进样可提高UVD的灵敏度，且采用电动进样，对进入毛细管中的样品具有选择性，样品基质中的一些杂质不能进入柱内，能较好地克服样品基质的影响。在优化试验条件下，与普通的CZE法比较，三聚氰胺的紫外检测灵敏度提高了800倍（图7-16），检出限由2.0mg/L降至2.5μg/L，线性范围为10~1 000μg/L，添加样品回收率为98%~106%，相对标准偏差均不高于5.1%。 6.3免疫分析法免疫分析法在食品安全检测中应用广泛，常被用作快速筛选方法。免疫学法是一种快速检测三聚氰胺的方法，其原理是利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺并进行免疫测定。该法优点是操作简便、分析速度快、可大批量筛选；缺点是与分析样品类似的结构物也可与特异性抗体发生反应，从而产生干扰，在检测过程中存在假阳性问题，对阳性样品需确证方法进行确证。三聚氰胺事件后，国内外开始研究三聚氰胺完全抗原的合成、多克隆抗体及单克隆抗体的制备等工作。由于三聚氰胺相对分子质量仅为126，是典型的小分子半抗原，用制备的三聚氰胺人工抗原来刺激机体免疫系统产生特异性抗体。首先需要选择合适的三聚氰胺结构类似物作为半抗原进行衍生化，然后采用合适的偶联方法将其与载体蛋白连接得到完全抗原，关键在于不能破坏其表面结构和保持最小的能量转移，这对制备出高灵敏度、高特异性和稳定性的三聚氰胺抗体是至关重要的。目前主要有ELISA法和胶体金免疫层析法。考虑到三聚氰胺具有环状对称的特殊结构，有3个氨基可供偶联载体，如果采用氨基的反应直接与蛋白连接，则3个氨基都可以同载体蛋白偶合，导致三聚氰胺完全被大分子蛋白包围，这样的抗原不能刺激产生高效价抗体。采用控制三聚氰胺和琥珀酸酐等量反应摩尔比的方法，只将其中1个氨基连接上带有羧基的4碳间隔臂以合成完全抗原。Wang等建立了一种间接竞争ELISA法，可用于检测猪和鸡的组织及体液中三聚氰胺残留，检测限为50ng/mL，同时用GC-MS法确证，两种方法显示出很好的相关性。Lei等以碳二亚胺法合成三聚氰胺完全抗原，并免疫动物得到特异性多克隆抗体，建立了特异性检测三聚氰胺的间接竞争ELISA法，检测限为5.2ng/mL，定量限为7.6ng/mL。Liu等首先对三聚氰胺进行衍生化合成完全抗原，并免疫动物得到了三聚氰胺的多克隆抗体，建立ELISA法，并对动物肌肉组织中三聚氰胺残留进行检测，检测限为1.8ng/g，样品添加回收率为84.6%~94.3%。Yin等制备了抗三聚氰胺单克隆抗体，并建立了检测牛奶、奶粉和动物饲料等样品中三聚氰胺残留的间接竞争ELISA法，实际样品检测限牛奶中为0.1mg/L、奶粉中为0.2mg/kg、饲料中为0.5mg/L，添加回收率为79%~110%。何方洋等利用三聚氰胺类似物与载体蛋白偶联合成免疫原及包被原，免疫BALB/c小鼠，制备了抗三聚氰胺的单克隆抗体。蔡家利等也成功制备了抗三聚氰胺单克隆抗体，检测限为0.15μg/mL，定量限为4.15μg/mL，除与三聚氰酸交叉反应率为72%外，与三嗪类药物及其他抗菌药物等交叉反应率均小于5%。目前，采用胶体金免疫层析法对三聚氰胺进行检测的研究很少。Li等建立了食品中三聚氰胺残留检测的胶体金免疫层析法，原料乳检测限为0.05μg/mL，动物饲料和奶粉检测限为1μg/g，其他奶制品检测限为2μg/g，整个检测过程在3~10min完成。6.4分子印迹技术分子印迹技术是近年发展起来的一种新方法，可为人们提供具有期望结构和性质的分子聚合体。目前，新型的光响应分子印迹材料成为科研学者关注的热点。这类功能化分子印迹材料通常是将偶氮苯作为功能单体引入分子印迹材料而制得的。由于偶氮苯化合物在光照下能在顺反两种构型之间可逆地进行转变，即在紫外光的照射下，偶氮苯由反式变为顺式；在热作用或可见光条件下，偶氮苯由顺式回到反式，因此在光响应性分子印迹材料中，作为特异性结合位点而存在的偶氮苯基团在光照下能够发生异构，引起MIP材料中特异性结合空腔的巨大变化，从而导致主-客体结合能力的改变。聂颖恬将分子印迹与偶氮苯光响应单体相结合，制备了含有偶氮苯光响应性功能单体的分子印迹水溶胶，该材料能在光照下实现对三聚氰胺分子的可控吸收和释放。此外，三聚氰胺在特异性结合空腔中与偶氮苯功能单体发生相互作用，能影响偶氮苯功能单体异构化速率，偶氮苯单体异构化速率改变的大小和三聚氰胺的浓度有关，基于此构建了一种新型的三聚氰胺快速检测法，能准确检出奶样中三聚氰胺的含量，前处理方便，测试过程快速，准确性较好，检测限可达0.25mg/kg。Pietrzyk等以三聚氰胺为模板分子、bis（2，2’-bithienyl）-benzo-[18-crown-6]methane为功能单体、3，3′-bis[2，20-bis（2，20-bithiophene-5-yl）]thianaphthene为交联单体，通过电聚合方式制备出三聚氰胺MIP膜，建立了基于MIP膜的三聚氰胺化学传感器分析法，其检测限为5×10－9mol/L，检测线性范围为5×10－9~1×10－3mol/L。Liang等也建立了基于MIP的电位传感器方法用于牛奶中三聚氰胺残留检测。以甲基丙烯酸为功能单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联单体制备MIP，然后联合离子选择电极检测牛奶中三聚氰胺，其检测限为6.0μmol/L。6.5近红外吸收检测法在三聚氰胺的分子结构中，3个C原子分别与2个N原子和1个-NH2连接。虽然C-N键的谱峰很难识别，但是-NH2的波动却是正好处于近红外区域，因此可以对三聚氰胺进行近红外分析。该方法的原理是用一种特定波长的近红外线照射被检样品，根据样品中三聚氰胺对红外线的吸收强弱来实现其含量的实时监测，该法是一种无接触、无损伤和无危害的检测方法。对于三聚氰胺而言，其含量越高所反射出的光线强度就越弱。同时该法预先扣除了蛋白质中-NH2含量的影响，选择性相对较好。徐云等结合光谱预处理和波长选择及模型优化方法建立了测定牛奶中三聚氰胺含量的近红外定量分析模型，具有较好的稳定性和重复性（相对标准偏差小于10%）。但该法设备价格昂贵，需要不断进行校准，不同样品基质中的干扰是近红外分析精度及重现性的一大�**�6.6荧光分析法三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，其分子中含有共轭双键（π键）结构及3个取代基-NH2，其激发态由环外氨基上的n电子激发转移到环上而产生。由于它们n电子的电子云几乎与芳环上π轨道平行，因而实际上它们共享了共轭π电子结构，扩大了其共轭双键体系，故具有荧光特性，在非极性的介质中，它的荧光较弱，随着介质极性的提高，其荧光强度也随之增大，当它处于酸性介质中时，取代基-NH2会质子化为-NH＋，荧光强度明显减弱，甚至无荧光发生；而在弱碱性介质中，其荧光强度明显增强。黄晖等利用三聚氰胺的荧光特性建立了用荧光分光光度法测定牛奶中三聚氰胺的方法。利用弱碱性介质中阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）对三聚氰胺荧光强度的增敏作用，在pH8.00的Tris-盐酸缓冲溶液中，以CTMAB为增敏剂，用荧光光度计测定三聚氰胺，线性范围为25~1000μg/L，检出限为19μg/L，相对标准偏差为1.6%。